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日本工業規格

JIS

 K

7001

-1990

工業用アミラーゼ

Amylase for industrial use

1.

適用範囲  この規格は,工業用アミラーゼ(以下,アミラーゼという。)について規定する。

備考1.  この規格の引用規格は,付表1に示す。

2.

この規格の中で  {  }  を付けて示してある単位及び数値は,従来単位によるものであって

考として併記したものである。

2.

共通事項  化学分析について共通する一般事項は,JIS K 0050 による。

3.

用語の定義  この規格で用いる主な用語の定義は,JIS K 0211 及び JIS K 3600 によるほか次のとおり

とする。

(1)

液化力  でんぷんのり(糊)に作用して,そのグルコシド鎖を内部から加水分解して低分子化するこ

とによって,でんぷんのりの粘度を低下させる活性をいう。

(2)

糖化力  でんぷん及びその分解物等に作用して,そのグルコシド鎖を加水分解し,還元力を生成する

活性をいう。

(3)

滅菌  対象物中のすべての微生物(ただし,ウィルスを除く。)を殺滅又は除去すること。

4.

種類  アミラーゼの種類は,表 のとおりとする。

表 1  アミラーゼの種類

種類

作用

主用途

高耐熱性

食品用

中耐熱性

でんぷん液化

(ぶどう糖製造,醸造)

高耐熱性

細菌液化型

アミラーゼ

EC 3.2.1.1

非食品用

中耐熱性

でんぷんなどの

α

−1,4−グルコシド鎖を内部か

ら分解し,低分子化して液化する。

織物ののり抜き

グルコアミラーゼ

EC 3.2.1.3

でんぷんなどの

α

グルコシド鎖を非還元性末端

からグルコース単位で逐次分解する。

ぶどう糖製造

精製品

β

−アミラーゼ

EC 3.2.1.2

一般品

でんぷんなどの

α

−1,4 グルコシド鎖を非還元末

端からマルトース単位で逐次分解する。

マルトース製造

プルラナーゼ

EC 3.2.1.41

でんぷん,プルランなどの分子の分岐点である

α

−1,6 グルコシド結合を分解する。

ぶどう糖及びマルトー

ス製造

備考1.  表1の EC 番号は国際生化学連合の酵素委員会で定めたものである。

2.

各製品には粉状品と液状品がある。

5.

品質  アミラーゼの品質は,表 のとおりとする。


2

K 7001-1990

表 2  アミラーゼの品質

種類

細菌液化型アミラーゼ

β

−アミラーゼ

食品用

非食品用

項目

高耐熱性

中耐熱性

高耐熱性

中耐熱性

グルコアミ

ラーゼ

精製品

一般品

プ ル ラ ナ

ーゼ

試験方法

液化力

(

1

)

JLU/g

又は JLU/ml

1 000

以上 300 以上

7.1

糖化力

(

2

)

 JGU/g

又は JGU/ml

− 5

000

以上

7.2

糖化力

(

3

)

JMU/g

又は JMU/ml

− 5

000

以上

1 000

以上

7.3

糖化力

(

4

)

JPU/g

又は JPU/ml

− 100 以上

7.4

重金属(Pb として)

wt ppm

40

以下

− 40 以下 40 以下

40

以下 40 以下

7.6

ひ素(As

2

O

3

として)

wt ppm

3

以下

3

以下

3

以下

3

以下

3

以下

7.7.1

は 7.7.2

一般細菌数

個/g 又は個/ml

1

×10

4

以下

1

×10

4

以下

1

×10

4

以下

1

×10

4

以下

7.8

(

1

)

アミラーゼがばれいしょでんぷん1g に相当する終濃度91g/l,pH6.0ののりに65℃で15分間作用するとき,このの
りの動粘度を250×10

-6

m

2

/s {250cSt}

(65℃測定)まで減少させる酵素量を1液化力単位 (JLU) とする。

(

2

) 1%

(反応液中)可溶性でんぷんと酵素を pH4.5,40℃で 10 分間作用させる。この条件下で 1 分間に 1

µmol のグ

ルコースに相当する還元力を生成するのに必要な酵素量を 1 糖化力単位 (JGU) とする。

(

3

) 1%

(反応液中)可溶性でんぷんと酵素を pH5.5,40℃で 10 分間作用させる。この条件下で 1 分間に 1

µmol のグ

ルコースに相当する還元力を生成するのに必要な酵素量を 1 糖化力単位 (JMU) とする。

(

4

) 0.2%

(反応液中)プルラン溶液と酵素を pH5.0,40℃で 30 分間作用させる。この条件下で 1 分間に 1

µmol のグ

ルコースに相当する還元力を生成するのに必要な酵素量を 1 糖化力単位 (JPU) とする。

6.

試料採取方法  試料採取方法は,次のとおりとする。

6.1

液状品  製造バッチごとに分け,各々のバッチから,そのバッチの容器の数の 10%以上に当たる数

の容器をランダムに抜きとり,各々の容器から

図 に示す液状試料採取器を用いて液を等量ずつ別の容器

にとり,直ちに密閉してよく混ぜた後,その中から約 50ml を採取して試料とする。

6.2

粉状品  6.1 と同じ要領で包装容器を抜き取り,その各包装容器から等量ずつ図 に示す粉状試料採

取器を用いてとり,その全部を混合した後,四分法によって縮分し,約 50g を採取して試料とする。


3

K 7001-1990

図 1  液状試料採取器 

図 2  粉状試料採取器 

7.

試験方法  試験方法は,次のとおりとする。

7.1

液化力  ばれいしょでんぷんを基質として酵素を作用させ,でんぷんの全体的低分子化に伴って低

下するでんぷんの粘度を測定する。

7.1.1

試薬及び器具  試薬及び器具は,次のとおりとする。

(1)

試薬

(a)

ほう酸緩衝液 (pH7.0)   JIS K 8863 に規定するほう酸 26.35g 及び JIS K 8866 に規定する四ほう酸

ナトリウム十水和物 7.15g を水に溶かし,1 000ml としたもの。

(b)

希釈用液 [pH8.0(

5

)] 

  JIS K 8963 に規定する硫酸カルシウム二水和物 0.344g を水に溶かし,ほう酸

緩衝液 (pH7.0) 20ml,ポリオキシエチレン (10) オクチルフェニルエーテル溶液(

6

)0.5ml

及び水を加

えて 1 000ml としたもの。

(c)

酢酸 (1mol/l)    JIS K 8355 に規定する酢酸 60g に水を加えて 1 000ml としたもの。

(d)

酢酸ナトリウム溶液 (1mol/l)    JIS K 8371 に規定する酢酸ナトリウム三水和物 136g を水に溶かし,

1 000ml

としたもの。

(e)

酢酸緩衝液 (pH6.0)   酢酸ナトリウム溶液 (1mol/l)  に酢酸 (1mol/l)  を加えて pH を 6.0 に調整した

もの(混合比約 95:5)


4

K 7001-1990

(f)

基質液  無水物として 10.00g に対応するばれいしょでんぷん(日本薬局方バレイショデンプン,乾

燥減量約 17%のもの)を正確にはかり,酢酸緩衝液 (pH6.0) 10ml 及び水を加えて正確に 100ml とし

たもの。使用の都度調製する。

(g)

粘度比較液  シリコーン油(

7

)

[ジメチルポリシロキサン]

(

5

)

ほう酸緩衝液 (pH7.0) を水で50倍に希釈すると pH は8.0となる。

(

6

)

ポリオキシエチレン (10) オクチルフェニルエーテル(例えば TritonX-100)10g に水を加え,

加温して溶かし,100ml とする。

(

7

) 25

℃における動粘度 500±25×10

-6

m

2

/s {500

±25cSt},粘度温度係数 0.60±0.02 のもの。このも

のの 65℃における動粘度は 250±20×10

-6

m

2

/s {250

±20cSt}  である。

(2)

器具

(a)

試験管  胴外径 18mm,高さ 180mm

(b)

恒温水槽  65±0.5℃に調節できるもの。

(c)

沸騰水槽

(d)

粘度比較液封入管  試験に使うものと同質同形の試験管に(1) (g)の粘度比較液 11ml (10.67g)  を封入

したもの。これを 2 本用意する。

7.1.2

試料溶液の調製  試料酵素に適量の希釈用液 (pH8.0) を加えて溶かし試料溶液とする(

8

)

。必要な

らば加温抽出及びろ過する。

(

8

)

試料溶液中の酵素量とこれが反応液の動粘度を250×10

-6

m

2

/s {250cSt}

まで減少させるに要す

る時間とはほぼ反比例する。したがって,未知の試料を試験する場合には,まず任意の試料溶

液を用いて試験操作を行い,反応液の動粘度が250×10

-6

m

2

/s {250cSt}

に達するまでの時間を求

め,これからその試料溶液1ml 中の酵素量を推定し,これに基づいて1JLU/ml を中心とする約5%

間隔の濃度の酵素に対応する一連の濃度の試料溶液を調製する。

7.1.3

操作方法  操作方法は,次のとおりとする。

(1)

基質液をでんぷんが均一に分散するように激しくかき混ぜながら素早く 10.0ml はかり試験管に入れ

る。

(2)

試料溶液 1ml を,全量ピペットを用いて試験管内の基質液 10ml に加える。

(3)

でんぷんが均一に分散するよう試験管を激しく振りながら沸騰水槽中で加熱し(

9

)

,でんぷんがこ(糊)

化したとき直ちに 65±0.5℃の恒温水槽に移す。

(4)

恒温水槽に移してから正確に 15 分後,同じ恒温水槽中にあらかじめ浸しておいた 2 本の粘度比較液封

入試験管の間に反応液入り試験管を挟んで,3 本の試験管をそろえて持ち,恒温水槽から取り出し,

その下部を水槽の縁にかけながら,口部を水平から約

π

/4rad {45

°}  下方へ急速に傾け,試験管内の液

の流動状態を観察する(

10

)

(5)

反応液から粘度比較液と同じ速さで流れるときの試料溶液 1ml 中の酵素量を 1JLU とする(

11

)

(

9

)

試験管にシリコーンゴム栓をし,激しく振ってでんぷんを均一に分散させた後,すばやく栓を

とり直ちに加熱を始める。加熱に用いる熱湯を沸騰水槽になるべく満たすと操作が行いやすい。

反応液の液化後に試験管の底に未反応のこ(糊)塊を認めたときは試験をやり直す。

(

10

)

高耐熱性のアミラーゼを試験する場合,観察操作を続けて繰り返すと,2 度目には 1 度目より

顕著に速く反応液が流れ,それ以後は流れがほぼ安定するという現象が見られる。そこで,所

定の反応時間(15 分)の 10 秒前及び 5 秒前の計 2 回観察操作を行ってその都度直ちに試験管

を恒温水槽に戻し,反応時間がちょうど 15 分になったときに 3 度目の観察操作を行って判定す


5

K 7001-1990

る。中耐熱性アミラーゼでは,高耐熱性のものの場合のような反応液の流れ方の急速な変化は

ない。

(

11

)

酵素濃度が異なる一連の試料溶液のうち,一つの試料溶液による 15 分後の反応液の動粘度が

250

×10

-6

m

2

/s {250cSt}

より高(低)く,その次の間隔の濃度の試料溶液では低(高)い場合,

1JLU/ml

に対応する試料濃度は両試料溶液の濃度の平均値とする。

7.1.4

計算  試料酵素の液化力は,次の式によって算出する。

a

b

ここに,  a:  液化力(JLU/g 又は JLU/ml) 

b

:  試料酵素の希釈倍数

7.2

糖化力(グルコアミラーゼ)  可溶性でんぷんを基質として酵素を作用させ,生成してくる還元力

をフェーリング・レーマン・シヨール変法によって測定する。

7.2.1

試薬及び器具  試薬及び器具は,次のとおりとする。

(1)

試薬

(a)

酢酸緩衝液 (pH4.5)   7.1.1(1)(c)の酢酸 (1mol/l)  に 7.1.1.(1)(d)の酢酸ナトリウム溶液 (1mol/l) を加

えた pH4.5 に調整し(混合比約 57.5:42.5)

,この液を 10 倍に希釈したもの。

(b)

基質液  JIS K 8659 に規定する可溶性でんぷんの無水物 10g を少量の水で懸濁させ,400ml の沸騰

水中に徐々に注加し,沸騰が中断しないように注意して 5 分間煮沸後,流水中で冷却した後,水を

加えて 500ml としたもの。使用の都度調製する。

(c)

フェーリング 液  JIS K 8983 に規定する硫酸銅 (II) 五水和物 69.3g を水に溶かして 1 000ml とし

たもの。

(d)

フェーリング 液  JIS K 8536 に規定する酒石酸カリウムナトリウム四水和物 346g 及び JIS K 8576

に規定する水酸化ナトリウム 103g を水に溶かして 1 000ml としたもの。

(e)

よう化カリウム溶液  JIS K 8913 に規定するよう化カリウム 300g を水に溶かして 1 000ml としたも

の。

(f)

硫酸 (250g/l)    JIS K 8951 に規定する硫酸 250g を約 250ml の水に注意しながら加え冷却後水を加

えて 1 000ml としたもの。

(g)

でんぷん溶液  可溶性でんぷん 1g を少量の水と混和し,50ml の沸騰水中に沸騰が止まらないよう

に徐々に加え,約 2 分間保持した後,冷却し水を加えて 100ml としたもの。

(h)  0.05mol/l

チオ硫酸ナトリウム溶液  JIS K 8637 に規定するチオ硫酸ナトリウム五水和物 50g 及び

JIS K 8625

に規定する炭酸ナトリウム

(無水)

0.2g

を新たに 2 分間煮沸冷却した水に溶かして 1 000ml

としたもの。この液には防腐のため JIS K 8051 に規定する 3−メチル−1−ブタノール(イソアミル

アルコール)2ml を添加してもよい。これを原液として保存するが使用する少なくとも 2 日前にい

ったん煮沸冷却した水で 4 倍に希釈して褐色瓶に貯える。標定は調製後 1 週間は毎日,その後は 3

日に 1 回行う。

標定  JIS K 8005 に規定するよう素酸カリウムを 120∼140℃で 2 時間乾燥し,シリカゲルデシケ

ーター中で放冷した後,約 0.36g を 0.1mg まではかりとり,水に溶かして全量フラスコ 250ml に入

れ,水を標線まで加える。その 25ml を共栓三角フラスコ 300ml にとり,よう化カリウム 2g 及び塩

酸 (2+1) 5ml を加え,

直ちに密栓して静かに混ぜ合わせ,

暗所に約 5 分間放置する。

これに水約 100ml

を加えた後,遊離したよう素をこのチオ硫酸ナトリウム溶液で滴定し,溶液の黄色が薄くなったら

指示薬としてでんぷん溶液 1ml を加え,生じたよう素でんぷんの青い色が消えるまで滴定する。別


6

K 7001-1990

に同一条件で空試験を行って補正を行い,次の式によってファクター  (

)

を算出する。

3

783

001

.

0

1

250

25

100

×

×

×

×

=

ò

x

d

c

ここに,

c

よう素酸カリウムのはかりとり量 (g)

d

よう素酸カリウムの含量 (%)

x

滴定に要した 0.05mol/チオ硫酸ナトリウム溶液(補
正した値) (ml)

0.001 783 3

0.05mol/l

チオ硫酸ナトリウム溶液 1ml に相当するよ

う素酸カリウムの量 (g)

(2)

器具

(a)

試験管  平底試験管(胴内径 30mm,高さ 120mm)で,アルミキャップ付きのもの。

(b)

恒温水槽  40±0.5℃に調節できるもの

(c)

沸騰水槽

(d)

ビュレット  最小目盛 0.1ml のもの。

7.2.2

試料溶液の調製  試料酵素を適量の水に溶かし,1∼5JGU/ml 程度になるように調製する。

7.2.3

操作方法  操作方法は,次のとおりとする。

(1)

基質液 3ml 及び酢酸緩衝液 2ml を試験管にとり,40±0.5℃の恒温水槽に 10∼15 分間保つ。

(2)

これに 40±0.5℃に加温した試料溶液 1.0ml を加え,よく振り混ぜ,直ちに同温度の恒温水槽に入れ正

確に 10 分間放置する(反応開始)

(3)

フェーリング B 液 2.0ml を加え,よく振り混ぜる(反応停止)

(4)

フェーリング A 液 2.0ml を加え,軽く振り混ぜた後,キャップを施し,沸騰水中で 15 分間加熱し,

直ちに流水中で 25℃以下に冷却する。

(5)

キャップを取り,よう化カリウム溶液 2ml 及び硫酸 (250g/l) 2ml を加え,直ちに 0.05mol/チオ硫酸ナ

トリウム溶液で滴定を行う。黄色がやや残る終点近くで指示薬としてでんぷん溶液 1∼2 滴を加え,青

色が消えるまで滴定し滴定値 f (ml)  を得る。

(6)

別に空試験としてフェーリング B 液と試料溶液の添加順序を逆にして(1)(5)の操作を行い,滴定値 g

(ml)

を得る。

(7)

滴定値から生成したグルコース量を,次の式によって算出する。

e

=  (gf)  ×1.62×

ここに,

e

生成したグルコース量 (mg)

f

滴定値 (ml)

g

空試験の滴定値 (ml)

1.62

0.05mol/l

チオ硫酸ナトリウム溶液 1ml に相当するグルコー

ス量 (mg)

 0.05mol/l

チオ硫酸ナトリウム溶液のファクター

なお,この定量法における還元力は,グルコースとして 0.2∼16mg の範囲内に入れる。

7.2.4

計算  試料酵素の糖化力は,次の式によって算出する。

j

i

h

×

×

=

10

1

18

.

0

ここに,

h

糖化力(

JGU/g

又は

JGU/ml

0.18

グルコース

1

µ

mol

に対応する

mg

i

生成したグルコース量

 (mg)


7

K 7001-1990

10

反応時間(分)

j

試料酵素の希釈倍数

7.3

糖化力(

β

−アミラーゼ)  7.2 と同じ原理の測定法を用いる。

7.3.1

試薬及び器具  試薬及び器具は,7.2.1 と同じ。ただし,(1)(a)の酢酸緩衝液の

pH

5.5

とする(酢

酸と酢酸ナトリウム溶液の混合比は約

13

87

7.3.2

試料溶液の調製  試料酵素を適量の水に溶かし,

1

5JMU/ml

程度になるように調製する。

備考

β

−アミラーゼの中には,その起源と精製度によって,水による希釈時に失活する場合がある。

この場合水以外の適当な希釈液を使うことができる。

7.3.3

操作方法  操作方法は,7.2.3 と同じ。

7.3.4

計算  試料酵素の糖化力は,次の式によって算出する。

m

l

k

×

×

=

10

1

18

.

0

ここに,

k

糖化力(

JMU/g

又は

JMU/ml

l

生成したグルコース相当量

 (mg)

m

試料酵素の希釈倍数

7.4

糖化力(プルラナーゼ)  プルランを基質として,酵素を作用させ,生成してくる還元力をソモギ

ー・ネルソン変法によって比色定量する。

7.4.1

試薬及び器具  試薬及び器具は,次のとおりとする。

(1)

試薬

(a)

くえん酸緩衝液 (0.05mol/l) (pH5.0)    JIS K 8283 に規定するくえん酸一水和物

52.54g

を水約

4l

溶かし,水酸化ナトリウム溶液

 (4.0mol/l

1.0mol/l)

pH5.0

に調整してから,水を加えて

5l

とし

たもの。この緩衝液は,使用時に調製し,

pH5.0

を確認して使用する。

(b)

基質液[4.0g/l]  プルラン(分子量

5

10

万,プルラナーゼで分解したときのマルトトリオース生

成量が

94%

以上のもの)

400mg

をくえん酸緩衝液で完全に溶かしてから更にくえん酸緩衝液を加え

全量を

100ml

としたもの。使用の都度調製する。

(c)

ソモギー試薬  次のとおり調製したもの。

炭酸ナトリウム(無水)

24.0g

,酒石酸カリウムナトリウム四水和物

12.0g

を水約

200ml

に溶かす

A

液)

A

液に,

あらかじめ水約

200ml

に硫酸銅

 (II)

五水和物

4.0g

を溶かした液を入れ,

次いで JIS K 8622

に規定する炭酸水素ナトリウム

16.0g

を加え溶かす(

B

液)

500ml

に JIS K 8987 に規定する硫酸ナトリウム(無水)

180g

を加えて加熱溶解し冷却後

B

に加え混合する(

C

液)

水を加えて

C

液を

1 000ml

としたものに沸騰石を入れ

10

分間煮沸し,

7

日間室温で放置する。JIS 

P 3801

に規定するろ紙

2

 (185mm)

2

枚重ねたものでろ過し,褐色瓶に入れる。室温保存で

3

か月を限度に使用する。

(d)

ネルソン試薬  次のとおり調製したもの。

900ml

に JIS K 8905 に規定するモリブデン酸アンモニウム四水和物

50.0g

を加えて加熱溶解し

冷却後,硫酸

42ml

を徐々に加えて混合する(

N

液)

。次に,ひ酸二ナトリウム七水和物

6.0g

を水約

50ml

に溶かしておき,その溶液を

N

液に加え混合し,水を加えて

1 000ml

とする。

37

℃で

24

時間

放置後,褐色瓶に入れる。室温保存で

3

か月を限度に使用する。使用時は安全ピペットを用いる。

(e)

グルコース溶液  JIS K 8824 に規定するぶどう糖(無水)を

105

℃で

6

時間乾燥し,デシケーター


8

K 7001-1990

(シリカゲル)

中で放冷し,

得た無水物

1.600g

をくえん酸緩衝液

 (0.05mol/l) (pH5.0)

200ml

とし,

このグルコース溶液

 (8.0g/l)

と,くえん酸緩衝液を用いて

16

µ

g/ml

40

µ

g/ml

80

µ

g/ml

120

µ

g/ml

160

µ

g/ml

の各濃度のグルコース溶液を調製したもの。

(2)

器具

(a)

試験管  胴外径

18mm

,高さ

180mm

のもの。

(b)

恒温水槽

40.0

±

0.5

℃に調節できるもの。

(c)

分光光度計

520nm

の測定ができるもの。

(d)

沸騰水槽

7.4.2

試料溶液の調製  試料の酵素に適量のくえん酸緩衝液

 (0.05mol/l) (pH5.0)

を加えて溶かし,試料溶

液とする。測定時の吸光度が

0.28

1.44

の範囲に入るように調製する。

7.4.3

操作方法  操作方法は,次のとおりとする。

(1)

試験管に試料溶液

1.0ml

を入れ,あらかじめ

40

℃の恒温槽に約

10

分間放置した基質液

1.0ml

を加えよ

く混合してから試験管にガラス球を乗せ恒温槽に戻す(反応開始)

(2)

正確に

30

分後,ソモギー試薬

2.0ml

を加え混合する(反応停止)

(3)

試験管を室温になるまで放置(約

30

分間)する。

(4)

別の試験管に,各濃度のグルコース溶液

2.0ml

をとり,ソモギー試薬各

2.0ml

を加え,混合する。

(5)

空試験として別の試験管に試料溶液

1.0ml

をとり,ソモギー試薬

2.0ml

を加えよく混ぜ,次に基質液

1.0ml

を加え混合後室温に放置する。

(6)

(3)

(4)及び(5)の試験管にガラス球を乗せ沸騰水槽で加熱する。加熱時間は試験管中の液が沸騰後正確

20

分間とする。

(7)

冷水で冷却する。

(8)

ネルソン試薬

2.0ml

を各試験管に加え,よく振り混ぜて赤色の沈殿物を完全に溶かす。

(9)

4.0ml

を加え混合し,

30

分間室温で放置する。

(10)

分光光度計で

520nm

の吸光度を測定する。

7.4.4

検量線の作成  グルコース濃度と吸光度との関係を表す検量線を図 のように作図し,そのこう配

α

)を求めておく。

α

は,直線回帰分析によっても求めることができる。

図 3  グルコース濃度と吸光度の関係

7.4.5

計算  試料酵素の糖化力は,次の式によって算出する。

(

)

30

180

2

×

×

×

×

=

α

P

OD

OD

h

B

s

ここに,

h

糖化力(

JPU/g

又は

JPU/ml


9

K 7001-1990

OD

s

試料液の吸光度

OD

B

空試験液の吸光度

α

検量線のこう配

2

反応液の体積

 (ml)

180

グルコースの分子量

30

反応時間(分)

P

試料の希釈倍数

7.5

細菌液化型アミラーゼの耐熱性の識別  酵素を加熱し,その活性の残存率から高耐熱性,中耐熱性

を識別する。

7.5.1

判定基準  判定基準は,表 による。

表 3  細菌液化型アミラーゼの耐熱性判定基準

アミラーゼの種類

加熱条件

活性残存率  %

高耐熱性 90℃  30 分 85 以上

中耐熱性 90℃  30 分

ほとんど 0

 75

℃  30 分 75 以上

7.5.2

試薬及び器具  試薬及び器具は,次のとおりとする。

(1)

希釈用液 (pH8.0)   7.1.1(1)(b)による。

(2)

加塩希釈用液  JIS K 8150 に規定する塩化ナトリウム

2g

を希釈用液

 (pH8.0)

に溶かし

1 000ml

とする。

(3)

試料溶液  試料に希釈用液

 (pH8.0)

を加えて溶かし約

1 000JLU/ml

の溶液とする。

(4)

試験管  胴外径

18mm

,高さ

180mm

のものと胴外径

24mm

,高さ

180mm

のもの。

(5)

恒温水槽

90

±

0.5

℃及び

75

±

0.5

℃に調節できるもの。

(6)

冷水槽

7.5.3

操作方法  操作方法は,次のとおりとする。

(1)

加塩希釈用液

19ml

を試験管(胴外径

24mm

)に入れ,緩く栓をして,

90

(又は

75

)±

0.5

℃の恒温水

槽中に

10

分間浸す。

(2)

これに試料溶液

1ml

を素早く加えて振り混ぜ,直ちに内容液約

3ml

を採取し,試験管(胴外径

18mm

に入れ,冷水槽中で冷却する(

A

液)

(3)

試料溶液を加えてから正確に

30

分後に,同様にして内容液約

3ml

を採取し冷却する(

B

液)

(4)

  A

液及び

B

液の活性を 7.1 によって測定する。

7.5.4

活性残存率の計算  活性残存率は,次の式によって算出する。

100

×

=

r

s

q

ここに,

q

活性残存率

 (%)

r

  A

液の活性

s

  B

液の活性

7.6

重金属  試料溶液に含まれる重金属が硫化ナトリウム溶液によって呈する硫化物の色と,鉛溶液が

硫化ナトリウム溶液によって呈する色とを比較することによって重金属の量を鉛

 (Pb)

の量として表す。

7.6.1

試薬  試薬は,次のとおりとする。

(1)

硫酸  JIS K 8951 に規定するもの。

(2)

硝酸  JIS K 8541 に規定する含量約

70%

のもの。

(3)

塩酸  JIS K 8180 に規定するもの。

(4)

塩化ヒドロキシルアンモニウム溶液  JIS K 8201 に規定する塩化ヒドロキシルアンモニウム

15.0g


10

K 7001-1990

500ml

の水に溶かしたもの。

(5)

酢酸 (1mol/l)    7.1.1(1)(c)によるもの。

(6)

鉛溶液 (0.1mgPb/ml)   JIS K 8563 に規定する硝酸鉛

0.160g

を硝酸

 (100g/l) 10ml

に溶かし,全量フラ

スコ

1 000ml

に入れ水を標線まで加えたもの。この液の調製及び保存には可溶性鉛塩を含まないガラ

ス器を用いる。

(7)

鉛溶液 (10

µgPb/ml)    鉛溶液

 (0.1mgPb/ml) 10ml

を全量フラスコ

100ml

にとり,水を標線まで加えた

もの。使用の都度調製する。

(8)

鉛標準液 Pb 10  JIS K 0015 に規定する

Pb 10

(9)

硫化ナトリウム溶液  JIS K 8949 に規定する硫化ナトリウム

5g

を水

10ml

及び JIS K 8295 に規定する

グリセリン

30ml

の混液に溶かしたもの。褐色瓶に保存し,調製後

3

か月以内に使用する。

7.6.2

器具  器具は,次のとおりとする。

(1)

るつぼ  磁製のもの。

(2)

電気炉

1 000

℃まで使用できるもの。

(3)

デシケーター  JIS Z 0701 に規定する

A

形のシリカゲルを乾燥剤としたもの。

(4)

沸騰水槽

(5)

比色管  図 にその例を示す。

図 4  比色管の例

7.6.3

操作方法  操作方法は,次のとおりとする。

(1)

電気炉(約

1 000

℃)で

1

時間空焼きし,放冷したるつぼに試料

1.0g

をはかりとる。

(2)

硫酸及び硝酸各

3

滴を加え,徐々に加熱し,なるべく低温で炭化又は揮散させた後,更に,

500

600

に強熱し,完全に灰化する。

(3)

デシケーター中で放冷した後塩酸

2ml

を加え,るつぼを時計皿で覆い沸騰水槽上で

10

分間加熱溶解

する。時計皿を取り除き,蒸発乾固させる。

(4)

次に塩化ヒドロキシルアンモニウム溶液

10ml

と酢酸

 (1mol/l) 2ml

を加え,沸騰水槽上で

5

分間加温し

た後比色管の中にろ過(JIS P 3801 に規定するろ紙

3

種による。

)して入れる。さらに,るつぼ,ろ紙,

漏斗を洗った水も比色管に入れ,水を加えて

50ml

とし,これを試験液とする。

(5)

別に試料に入れないで,(1)(4)の操作を行って比較液とする。ただし,比色管にはあらかじめ鉛溶液

(10

µ

gPb/ml)

又は鉛標準液

Pb10 4.0ml

を入れておく。


11

K 7001-1990

(6)

(4)

で得られた試験液と(5)で得られた比較液に硫化ナトリウム溶液を

2

滴ずつ加えてそれぞれよく振

り混ぜる。

(7)

  5

分間放置後両管を白色の背景を用いて上方又は側方から観察して液の色を比較する。試験液の色が

比較液の色より濃くない場合は試料中の重金属は鉛として

40wt ppm

以下である。

7.7

ひ素

7.7.1

臭化水銀紙法  試料中のひ素化合物を還元して水素化ひ素とし,これと臭化水銀

 (II)

との反応に

よる呈色を標準色と比較してひ素の量を三酸化ひ素

 (As

2

O

3

)

の量として表す。

(1)

試薬及び器具(

12

)

  試薬及び器具は,次のとおりとする。

(1.1)

試薬

(a)

硝酸マグネシウム・エタノール溶液  JIS K 8567 に規定する硝酸マグネシウム

1g

を JIS K 8101 

規定するエタノールに溶かして

50ml

としたもの。

(b)

硝酸  7.6.1(2

)

による。

(c)

塩酸  7.6.1(3)による。

(d)

ブロムフェノールブルー溶液  JIS K 8844 に規定するブロムフェノールブルー

0.1g

を希エタノール

100ml(

13

)

に溶かしたもの。必要があればろ過する。

(e)

アンモニア水  JIS K 8085 に規定する含量

28.0

30.0%

のもの。

(f)

アンモニア水 (100g/l)

  (e)のアンモニア水

40ml

に水を加えて

100ml

としたもの。ポリエチレン瓶

に入れる。

(g)

塩酸 (100g/l)    (c)の塩酸

24ml

に水を加えて

100ml

としたもの。

(h)

塩酸 (200g/l)    (c)の塩酸

47ml

に水を加えて

100ml

としたもの。

(i)

よう化カリウム溶液  JIS K 8913 に規定するよう化カリウム

16.5g

を水に溶かし

100ml

としたもの。

使用の都度調製し,遮光瓶に入れる。

(j)

塩化すず (II) 溶液  JIS K 8136 に規定する塩化すず

 (II) 4g

(c)の塩酸

125ml

に溶かし,

水で

250ml

としたもの。共栓瓶に保存し,

1

か月以内に使用する。

(k)

亜鉛  JIS K 8012 に規定するひ素分析用で粒径約

800

µ

m

のもの。

(l)

臭化水銀紙  JIS K 8513 に規定する臭化水銀

 (II) 5.0g

にエタノール

 (99.5) 100ml

を加え,穏やかに

加熱して溶かし,この液にクロマトグラフィー用ろ紙(幅約

4cm

,長さ約

10cm

に切ったもの)を

暗所で約

1

時間浸した後,試験に用いる部分に直接手を触れないようにして液から引き上げ,ガラ

ス棒につり下げて自然乾燥させ,乾燥後,周囲を切り捨て約

2cm

平方に切り,更に,四隅を切りと

ったもの。遮光して暗所に保存する。

(m)

ひ素溶液 (0.1mgAs

2

O

3

/ml) 

  JIS K 8044 に規定する三酸化二ひ素を微粉末とし,

105

℃で

4

時間乾

燥し,その

0.100g

を水酸化ナトリウム溶液

 (200g/l)

(

14

)

 5ml

に溶かす。この液に硫酸

 (100g/l)

(

15

)

加えて中和し,更に,

10ml

を加えた後,全量フラスコ

1 000ml

に移し入れ,新たに煮沸し冷却した

水を標線まで加えたもの。

(n)

ひ素溶液 (1

µgAs

2

  O

3

/ml) 

  ひ素溶液

 (0.1mgAs

2

O

3

/ml) 10ml

を全量フラスコ

1 000ml

にとり硫酸

(100g/l) 10ml

を加え,新たに煮沸し冷却した水を標線まで加えたもの。この液は使用の都度調製し,

共栓瓶に保存する。

(o)

酢酸鉛溶液  JIS K 8374 に規定する酢酸鉛三水和物

9.5g

に新たに煮沸し冷却した水を加えて溶かし

100ml

としたもの。密栓して保存する。

(

12

)

試験に用いる試薬,器具はひ素を含まないか又はほとんど含まないものを用いる。


12

K 7001-1990

(

13

)

エタノール

 (99.5) 1

容に水

1

容を加えたもの。

(

14

)

JIS K 8576

に規定する水酸化ナトリウム

20g

を水で溶かし

100ml

とする。

(

15

)

硫酸

5.7ml

を水

10ml

に徐々に加え,冷却後水を加えて

100ml

とする。

(1.2)

器具  ひ素試験装置を用いる。その例を図 に示す。

図 5  ひ素試験装置の例(

16

)

(

16

)

(a) 

排気管 B に約 30mm の高さにガラス繊維 F を約 0.2g 詰める。

(b) 

酢酸鉛溶液及び水の等量混液でガラス繊維を均等に潤す。

(c) 

下端から弱く吸引して,過量の液を除く。

(d) 

これをゴム栓 H の中心に垂直に差し込み,B の下部の小孔 E は下にわずかに突き出るようにして発
生瓶 A に付ける。

(e)  B

の上端にガラス管 C を垂直に固定したゴム栓 J を付ける。C の下端は J の下端と同一面とする。

(f) 

使用直前に C 及び D のすり合わせ面の間に臭化水銀紙 G を挟み,クリップ K で C 及び D を固定す
る。 

(1.3)

試料溶液の調製  試料溶液の調製は,次のとおりとする。

(a)

試料

1.0g

を白金製,石英製又は磁製のるつぼにとる。

(b)

硝酸マグネシウム・エタノール溶液

10ml

を加える。

(c)

るつぼ内に点火して燃焼させた後,徐々に加熱して灰化する。

(d)

炭化物が残るときは,少量の硝酸で潤し,再び加熱して灰化する。

(e)

冷却後,残留物に塩酸

3ml

を加え,沸騰水槽上で加温して溶かし試料溶液とする。

(1.4)

操作方法  操作方法は,次のとおりとする。(図 参照)

(a)

発生瓶

A

に試料溶液をとり少量の水で洗いこむ。

(b)

ブロムフェノールブルー溶液

1

滴を加え,アンモニア水

 (100g/l)

又は塩酸

 (100g/l)

を用いて中和し

た後,塩酸

 (200g/l) 5ml

及びよう化カリウム溶液

5ml

を加え,

2

3

分間放置する。

(c)

塩化すず

 (II)

溶液

5ml

を加え,

10

分間放置する。


13

K 7001-1990

(d)

水を標線

L

まで加える。

(e)

亜鉛

2g

を加え,直ちに

B

C

G

及び

D

を連結したゴム栓

H

を発生瓶

A

に付け(

17

)

25

℃の水中に

発生瓶

A

の肩まで浸す。

(f)

  1

時間放置後,直ちに臭化水銀紙の色を

(g)

の標準色と比較する(

18

)(

19

)

この色が標準色より濃くない場合は,試料中のひ素は三酸化ひ素として

3wt ppm

以下である。

(g)

標準色の調製  標準色の調製は(a)(e)と同時に行う。

別の発生瓶

A

にひ素溶液

 (1

µ

gAs

2

O

3

/ml) 3.0ml

をとり,塩酸

 (200g/l) 5ml

及びよう化カリウム溶液

5ml

を加えて

2

3

分間放置し,(c)(e)の操作を行う。得た臭化水銀紙の呈色を標準色とする。

(

17

)

発生ガスが漏れないように,臭化水銀紙を挟むすり合わせ部は緊密につなぐ。

(

18

)

臭化水銀紙の呈色は,光,熱,湿気などによって退色するので比色は速やかに行う。

デシケーター中に光を遮っておけば,しばらく保存することができる。

(

19

)

器具

2

個ずつを用いて行い,もし同じ操作によって得た呈色の程度が異なるときには操作をや

り直す。

7.7.2

ジエチルジチオカルバミン酸銀法  試料中のひ素化合物を還元して水素化ひ素として発生させ,こ

れとジエチルジチオカルバミン酸銀との反応で生じる赤紫の呈色を標準色と比較してひ素の量を三酸化二

ひ素

 (As

2

O

3

)

の量として表す。

(1)

試薬及び器具(

20

)

  試薬及び器具は,次のとおりとする。

(1.1)

試薬

(a)

硝酸マグネシウム・エタノール溶液  7.7.1(1)(1.1)(a)による。

(b)

硝酸  7.7.1(1)(1.1)(b)による。

(c)

塩酸  7.7.1(1)(1.1)(c)による。

(d)

ブロムフェノールブルー溶液  7.7.1(1)(1.1)(d)による。

(e)

アンモニア水  7.7.1(1)(1.1)(e)による。

(f)

アンモニア水

(100g/l

  7.7.1(1)(1.1)(f)による。

(g)

塩酸 (100g/l)    7.7.1(1)(1.1)(g)による。

(h)

塩酸 (200g/l)    7.7.1(1)(1.1)(h)による。

(i)

よう化カリウム溶液  7.7.1(1)(1.1)(i)による。

(j)

塩化すず (II) 溶液  7.7.1(1)(1.1)(j)による。

(k)

亜鉛  7.7.1(1)(1.1)(k)による。

(l)

ひ化水素吸収液  JIS K 9512 に規定するジエチルジチオカルバミン酸銀

0.50g

をピリジンに溶かし

100ml

としたもの。遮光した共栓瓶に入れ冷所に保存する。

(m)

ひ素溶液 (0.1mgAs

2

O

3

/ml) 

  7.7.1(1)(1.1)(m)による。

(n)

ひ素溶液 (1

µgAs

2

O

3

/ml) 

  7.7.1(1)(1.1)(n)による。

(o)

ピリジン  JIS K 8777 に規定するもの。

(

20

)

試験に用いる試薬及び器具はひ素を含まないか,又はほとんど含まないものを用いる。

(1.2)

器具  図 に示す水素化ひ素発生装置を用いる。その例を図 に示す。


14

K 7001-1990

図 6  水素化ひ素発生装置の例(

21

)

(

21

)

(a) 

排気管 B に約 30mm の高さにガラス繊維 F を詰める。

(b) 

酢酸鉛溶液及び水の等量混液で均等に潤す。

(c) 

下部から弱く吸引して,過量の液を除く。

(d) 

これをゴム栓 H の中心に垂直に差し込み,B の下部の小孔 E は下にわずかに突き出るようにして発生

瓶 A に付ける。

(e) B

の上端にガラス管 C を垂直に固定したゴム栓 J を付ける。

C

の排気管側の下端はゴム栓 J の下端と同一平面とする。 

(1.3)

試料溶液の調製法  7.7.1(1)(1.3)による。

(1.4)

操作方法  操作方法は,次のとおりとする。(図 参照)

(a)

発生瓶

A

に試料溶液をとり,少量の水で洗いこむ。

(b)

ブロムフェノールブルー溶液

1

滴を加え,アンモニア水

 (100g/l)

又は塩酸

 (100g/l)

を用いて中和し

た後,塩酸

 (200g/l) 5ml

及びよう化カリウム溶液

5ml

を加え,

2

3

分間放置する。


15

K 7001-1990

(c)

塩化すず

 (II)

溶液

5ml

を加え,

10

分間放置する。

(d)

水を標線

L

まで加える。

(e)

亜鉛

2g

を加え,直ちに

B

及び

C

を連結したゴム栓

H

を発生瓶

A

に付ける。

C

の細管部の端はあら

かじめ,水素化ひ素吸収液

5ml

を入れた吸収管

D

の底に達するように入れておく。

(f)

発生瓶

A

25

℃の水中に肩まで浸し,

1

時間放置する。

(g)

吸収管を外し,必要ならばピリジンを加えて

5ml

とし,吸収液の色と標準色の色とを比較する(

22

)

吸収液の色は標準液の色より濃くてはならない。

(h)

標準色の調製  標準色の調製は(a)(f)と同時に行う。

発生瓶

A

にひ素溶液

 (0.1

µ

gAs

2

O

3

/ml) 3ml

を正確にとり,塩酸

 (200g/l) 5ml

及びよう化カリウム溶

5ml

を加えて

2

3

分間放置し,(c)(f)の操作を行う。

吸収管を外し,必要ならばピリジンを加えて

5ml

とし,得た吸収液の呈色を標準色とする。この

色は,三酸化二ひ素

 (As

2

O

3

) 3

µ

g

に対応する。

(

22

)

器具

2

個ずつを用いて行い,もし同じ操作によって得た呈色の程度が異なるときには操作をやり

直す。

7.8

一般細菌数  標準寒天培地を用いて

35

±

1

℃で

24

±

2

時間又は

48

±

2

時間培養し,培地上に形成され

たコロニー数を求め,試料

1g

又は

1ml

中の細菌の個数で表示する。

7.8.1

試験の一般条件  試験の一般条件は,次のとおりとする。

(1)

この試験に使用する試薬及び器具など必要なものはすべて滅菌したものを用いる。

(2)

操作は,厳密な無菌的注意のもとで行う。

(3)

本試験は,微生物学全般の基礎知識をもち,しかも微生物の取扱いに習熟した者が行う。

7.8.2

試料採取方法  試料採取方法は,次のとおりとする。

(1)

器具

(a)

試料採取器  図 及び図 による。アルミはく(箔),硫酸紙などで包んで 7.8.3(3)(a)の乾熱滅菌を

しておく。

(b)

全量ピペット  容量

10ml

のもの。アルミはく,硫酸紙などに包んで,ピペット滅菌箱に先端を先

にして入れ,7.8.3(3)(a)の乾熱滅菌をしておく。

(c)

スパテラ  アルミはくなどに包んで 7.8.3(3)(a)の乾熱滅菌をしておく。

(d)

試料採取瓶  使用水量の

2

倍以上の容量の広口共栓ガラス瓶を用い,開口頭部をアルミはくで覆っ

て,細ひもでしっかり結んでから 7.8.3(3)(a)の乾熱滅菌をしておく(

23

)

(

23

)

あらかじめ栓と口の間にアルミはくの小片を挟んでおくと,滅菌後栓の固着を防げる。

(2)

試料の採取・調製(

24

)

(a)

液状品  製造バッチごとに分け,各々のバッチから

2

個以上の包装容器をランダムに抜き取り,

各々

容器の取り出し口部分を 7.8.3(4)(b)の消毒方法で消毒した後,開封し,その内容を液状試料採取器

を用いて液を等量ずつ試料採取瓶にとり,直ちに密閉してよく混ぜた後,その中から正確に

10ml

を全量ピペットで試料希釈瓶にとり滅菌りん酸塩緩衝液を加えて,全量を

100ml

とし,密栓して,

よく振り混ぜ,これを試料とする。

なお,液状試料採取器は,各バッチの容器ごとに取り替えて使用する。

(b)

粉状品  (a)と同じ要領で包装容器を抜き取り,その容器の表面を 7.8.3(4)(b)の消毒方法で消毒した

後,滅菌した器具を用いて開封し,それぞれから等量ずつ

図 に示す試料採取器を用いて試料採取

瓶にとり,その全部をよく混ぜた後,無菌的に正確に

10g

を試料希釈瓶にはかりとり,滅菌りん酸


16

K 7001-1990

塩緩衝液を加えて,全量を

100ml

とし,密栓してよく振り混ぜ,これを試料とする。

なお,試料採取器は,各バッチの容器ごとに取り替えて使用する。

(

24

)

試料の採取後,速やかに7.8.3(5)及び7.8.4(1)の操作を行う。やむを得ない理由ですぐには行えな

いときは,試料を

5

℃で保存しておき,

24

時間以内に行う。

7.8.3

試薬及び器具  試薬及び器具は,次のとおりとする。

(1)

試薬及び培地  試薬及び培地は,次のとおり調製する。

(a)

りん酸塩緩衝液希釈水  JIS K 9007 に規定するりん酸二水素カリウム

34g

500ml

の水に溶かし,

これに水酸化ナトリウム溶液(約

1mol/l

(

25

)

175ml

を加えた後,水を加えて

1 000ml

とし,更に塩

 (1mol/l)

(

26

)

又は水酸化ナトリウム溶液

 (1mol/l)

pH

7.2

に調整しこれを原液とする(

27

)

。使用

時にこの原液

1ml

を水

800ml

に加え,(3)(b)の高圧蒸気滅菌を

15

分間行う。

(b)

標準寒天培地(

28

)

  ペプトン(カゼインをパンクレアチンで加水分解したもの。

5g

,酵母エキス(粉

末)

2.5g

D

−グルコース[JIS K 8824 に規定するぶどう糖(無水)

1g

及び JIS K 8263 に規定する

寒天(粉末)

15g

を水

1 000ml

に加え,加熱して溶かす。

pH

7.1

±

0.2

に調整(

29

)

し,試験管又はフ

ラスコに分注し,(3)(b)の高圧蒸気滅菌を行う。

備考

培地の取扱いにおいて,次の点に注意する。

(1)

培地調製用の試薬類は,吸湿したり変質したものは使用しない。

(2)

原料を統一し,培地の品質を一定にするために,市販の粉末培地の使用が好ましい。粉末の培地

は密栓し,低湿の冷暗所に保存し,開封後

6

か月間以内に使用する。有効期間内であっても,変

色したり,固化したものは使用しない。

(3)

調製した培地の保存及び保存法  滅菌した培地は,冷蔵庫内に保存し,水分の蒸発を防ぐ。室温

で保存する場合には,

1

週間以上経過したものは用いない。使用前に一夜インキュベーターに入れ,

雑菌による汚染のないことを確認する。

(

25

)

JIS K 8576

に規定する水酸化ナトリウム

40g

を水に溶かして

1 000ml

とする。

(

26

)

塩酸

90ml

に水を加えて

1 000ml

とする。

(

27

)

原液は冷蔵保存を行う。

(

28

)

市販の粉末培地を使用してもよい。

(

29

)

 pH

の調整には,水酸化ナトリウム溶液

 (1mol/l)

又は塩酸

 (1mol/l)

などを用いる。水酸化ナト

リウム溶液で培地の

pH

を調整したとき,滅菌後の培地の

pH

は通常約

0.2

低下することに注意

して培地の

pH

を調整する。

(2)

器具及び装置  器具及び装置は,次のとおりとする。

(a)

全量ピペット  容量

1ml

のもの。アルミはく,硫酸紙などに包んで,ピペット滅菌箱に先端を先に

して入れ,(3)(a)の乾熱滅菌をしておく。

(b)

希釈瓶  使用水量の

2

倍以上の容量の共栓ガラス瓶又は綿栓した試験管若しくは三角フラスコ。い

ずれの場合も開口頭部をアルミはくで覆って細紐でしっかり結んでから,(3)(a)の乾熱滅菌をしてお

く。

9ml

又は

99ml

目盛りを付けておくと,あらかじめ希釈水を入れておく場合にも便利である。

(c)

シャーレ  JIS R 3503 に規定するペトリ皿のうち呼び寸法

90

×

15mm

のもの。アルミはく,硫酸紙

などに包んで,シャーレ滅菌箱に入れて(3)(a)の乾熱滅菌しておく。JIS K 0950 に規定するプラスチ

ック製滅菌シャーレを使用してもよい。

(d)

フラスコ  容量

300

500ml

及び

1

2l

のもの。培地や希釈水の調製に用いる。綿栓をして(3)(a)

乾熱滅菌又は(3)(b)の高圧蒸気滅菌をしておく。


17

K 7001-1990

(e)

綿  脱脂をしていない,繊維の長い木綿わた。

(f)

インキュベーター

35

±

1

℃に調節できるもの。

(g)

乾熱滅菌器

160

200

℃に調節できるもの。

(b)

高圧蒸気滅菌器  JIS T 7322 若しくは JIS T 7324 に規定するもの,又はそれらと同等以上の性能を

もつもの。

(3)

滅菌方法  滅菌方法は,次のとおりとする。

(a)

乾熱滅菌  乾熱滅菌は,乾熱滅菌器を用い,

170

℃で

1

時間滅菌する。自記温度計を備え付け,滅菌

器内の温度が均一な場合には

160

℃でもよい。ガラス器具類及びスパテラの滅菌はこの方法による。

(b)

高圧蒸気滅菌  高圧蒸気滅菌は高圧蒸気滅菌器を用い,

121

℃で

15

分間滅菌する。培地,りん酸塩

緩衝液希釈水,使用済みの培地,器具などの滅菌はこの方法による。

(c)

火炎滅菌  りん酸塩緩衝液希釈水や培地を入れた試験管やフラスコの口部の滅菌に用いる。試験管

やフラスコの綿栓を抜いた直後及び培養の操作を終わって綿栓をする直前に試験管やフラスコの口

部を上にして傾けて持ち回しながらその口部が火炎の中に

2

3

秒間回すようにして滅菌する。

(4)

消毒方法  消毒方法は,次のとおりとする。

(a)

試験操作の前後には手指や実験台を消毒する。手指の消毒にはクレゾール石けん溶液

 (1vol%)

,陽

性石けん溶液

 (1.0

10g/l)

,消毒用アルコール[エタノール

 (70vol%)

]を用いる。

実験台は陽性石けん溶液

 (1vol%)

,クレゾール石けん溶液

 (3vol%)

などを噴霧するか,これらを

布に含ませてぬぐう。

(b)

包装容器の取り出し口部分又は包装容器の表面は,陽性石けん溶液

 (10g/l)

,クレゾール石けん溶液

(3vol%)

などを布に含ませてぬぐう。

(c)

使用済みの器具,ピペット,試料採取瓶,試料希釈瓶などの器具は(3)(b)の高圧蒸気滅菌を行ってか

ら,よく水洗いする。

(d)

培養試験後の試験管,シャーレ類は培地ごとに(3)(b)の高圧蒸気滅菌した後,培地を捨ててからよく

水洗いする。

(5)

試料の希釈  試料の希釈は,次のとおりとする。

(a)

7.8.2(2)

で採取・調製した試料を十分に振り混ぜて均一にした後,その

1ml

を全量ピペット

1ml

でと

り,りん酸塩緩衝液希釈水

9ml

を入れた希釈瓶に加えてよく振り混ぜる。

(b)

次に,その

1ml

をとり(a)と同じ操作で数段階の希釈試料を作り,一般細菌数が培養後

30

300

個の

範囲内の集落が得られる希釈試料を作る(

30

)

なお,全量ピペット

1ml

は,その都度滅菌済みのものを用いる。

(

30

)

予備試験を行って,あらかじめ適当な希釈率を求めておくとよい。

7.8.4

操作方法  操作方法は,次のとおりとする。

(1)

分離及び培養

(a)

7.8.2(2)

で採取・調製した試料又は 7.8.3(5)の希釈試料

1ml

ずつを全量ピペット

1ml

を用いてそれぞ

2

個以上のシャーレにとる(

31

)

(b)

標準寒天培地を水浴中で加熱して溶かした後,

40

50

(

32

)

に保ち,その約

15ml

を無菌的にそれぞ

れのシャーレに加え,培地がシャーレのふたに付着しないように注意しながら,静かに回転,又は

前後左右に傾斜させて,培地と試料をよく混合する。

(c)

シャーレを水平に放置し,培地を冷却凝固させる。

(d)

培地が凝固したら,シャーレを逆さにしてインキュベーター(

33

)

に入れる。


18

K 7001-1990

(e)

 35

±

1

℃で

24

±

2

時間,又は

48

±

2

時間培養する。

(f)

対照として試料又は希釈検体試料の代わりにりん酸塩緩衝液希釈水

1ml

を用いて(a)(e)の操作を

同時に行う。

(

31

)

調製試料又は希釈試料をシャーレにとってから,培地を注入するまでに,

20

分以上経過しては

ならない。

(

32

)

調製試料又は希釈試料に注入する培地の温度はできるだけ低いことが望ましい。

(

33

)

インキュベーターにシャーレを入れる際,シャーレを密積したり,包んだりしてはならない。

(2)

細菌数の計測(

34

)

(a)

 30

300

個のコロニー数が得られた平板を取り出し,培地に発生したコロニー数を数え,それらの

平均値を求めてそれに希釈倍数を乗じて,試料

1g

又は

1ml

中の細菌数を求める。

(b)

全平板のコロニー数が

300

以上の場合は,その希釈倍率の最も高いものについて密集コロニー平板

測定法によって細菌数を測定する。すなわち,平板の一部分のコロニー数を正確に

1cm

2

の区画のあ

る計算板を用いて次の要領によって測定し,それから平板全面のコロニー数を算出する。

1cm

2

にコロニー数が

10

以下の場合は,コロニー計算板の中心を通過し直交する

2

直径を作り,

その中心から各

1cm

ずつ区分し,

6

か所の区画の面積中にあるコロニー数を測定し,

1cm

2

の平均コ

ロニー数を求め,これに平板全面積を乗じて算出する(

35

)

1cm

2

にコロニー数が

10

を超える場合は上記の場合の

4

区画について測定し,同様に算出する。

以上の操作によって求めたコロニー数の平均値を求め,希釈倍数を乗じて試料

1g

又は

1ml

中の細

菌数を求める。

(c)

コロニー数が

30

以下の場合は,その最も希釈倍率の低い平板のコロニー数を数え,平均値を求めて

それに希釈倍数を乗じて試料

1g

又は

1ml

中の細菌数を求める。

(d)

平板に拡散コロニーのある場合は,次の条件のものに限り,それ相当の部分を計測する。

(i)

他のコロニーがよく分散していて,拡散コロニーがあっても計測に支障が無いもの。

(ii)

拡散コロニーの部分が平板の

2

分の

1

以下の場合。

(e)

試験室内事故  次のような特殊な事故に対しては,試験室内事故として記録する。

(i)

コロニーが発生しなかった場合。

(ii)

拡散コロニーの部分が平板の

2

分の

1

を超える場合。

(iii)

汚染されたことが明らかなもの。

(iv)

その他不適当と思われるもの。

(

34

)

菌数が

100

以上の場合には,有効数字

2

けたに数値を丸める。

(

35

)

シャーレの内径が

90mm

の場合,

1cm

2

内の平均コロニー数に

65

を乗じると,その平板の推定

コロニー数が得られる。

8.

表示  容器又は包装に次の事項を表示しなければならない。ただし,大型容器の場合は,送り状に表

示してもよい。

(1)

種類・起源

(2)

活性

(3)

製造業者名

(4)

製造年月日又は出荷年月日

(5)

内容量


19

K 7001-1990

付表 1  引用規格

JIS K 0015

  鉛標準液

JIS K 0050

  化学分析方法通則

JIS K 0211

  分析化学用語(基礎部門)

JIS K 0950

  プラスチック製滅菌シャーレ

JIS K 3600

  バイオテクノロジー用語

JIS K 8005

  容量分析用標準試薬

JIS K 8012

  亜鉛(試薬)

JIS K 8044

  三酸化二ひ素(亜ひ酸)

(試薬)

JIS K 8051

  イソアミルアルコール(試薬)

JIS K 8085

  アンモニア水(試薬)

JIS K 8101

  エタノール

 (99.5)

[エチルアルコール

 (99.5)

(試薬)

JIS K 8136

  塩化第一すず(試薬)

JIS K 8150

  塩化ナトリウム(試薬)

JIS K 8180

  塩酸(試薬)

JIS K 8201

  塩酸ヒドロキシルアミン(試薬)

JIS K 8263

  寒天(試薬)

JIS K 8283

  くえん酸一水和物(試薬)

JIS K 8295

  グリセリン(試薬)

JIS K 8355

  酢酸(試薬)

JIS K 8371

  酢酸ナトリウム三水和物(試薬)

JIS K 8374

  酢酸鉛(

3

水和物)

(試薬)

JIS K 8513

  臭化水銀

 (II)

(試薬)

JIS K 8536

  酒石酸ナトリウムカリウム四水和物(試薬)

(ロシェル塩,セニエット塩)

JIS K 8541

  硝酸(試薬)

JIS K 8563

  硝酸鉛(試薬)

JIS K 8567

  硝酸マグネシウム(試薬)

JIS K 8576

  水酸化ナトリウム(試薬)

JIS K 8622

  炭酸水素ナトリウム(重炭酸ナトリウム)

(試薬)

JIS K 8625

  炭酸ナトリウム(無水)

(試薬)

JIS K 8637

  チオ硫酸ナトリウム(試薬)

JIS K 8659

  でんぷん(溶性)

(試薬)

JIS K 8777

  ピリジン(試薬)

JIS K 8824

  ぶどう糖(無水)

(試薬)

JIS K 8844

  ブロムフェノールブルー(試薬)

JIS K 8863

  ほう酸(試薬)

JIS K 8866

  四ほう酸ナトリウム(ほう砂)

(試薬)

JIS K 8905

  モリブデン酸アンモニウム(試薬)

JIS K 8913

  よう化カリウム(試薬)


20

K 7001-1990

JIS K 8949

  硫化ナトリウム(試薬)

JIS K 8951

  硫酸(試薬)

JIS K 8963

  硫酸カルシウム(

2

水塩)

(試薬)

JIS K 8983

  硫酸銅

 (II)

五水和物(試薬)

JIS K 8987

  硫酸ナトリウム(無水)

(試薬)

JIS K 9007

  りん酸二水素カリウム(試薬)

JIS K 9512

  ジエチルジチオカルバミン酸銀(試薬)

JIS P 3801

  ろ紙(化学分析用)

JIS R 3503

  化学分析用ガラス器具

JIS T 7322

  医療用高圧蒸気滅菌装置

JIS T 7324

  医療用小形高圧蒸気滅菌器

JIS Z 0701

  包装用シリカゲル乾燥剤

化学分析部会  バイオテクノロジー専門委員会  構成表

氏名

所属

(委員会長)

鈴  木  周  一

埼玉工業大学工学部

川  瀬      晃

工業技術院化学技術研究所化学標準部

山  内  愛  造

工業技術院繊維高分子材料研究所素材合成部

太  田  隆  久

東京大学農学部

遠  藤      勲

理化学研究所化学工学研究室

大  熊  道  雄

横浜国立大学工学部

増  田      優

通商産業省基礎産業局

長  沢  勝  利

財団法人バイオインダストリー協会

白  木      勝

工業技術院微生物工業技術研究所

細  川  幹  夫

工業技術院標準部

角  田      勝

三菱化成株式会社ライフサイエンス室

三  木  敬三郎

東亜燃料工業株式会社基礎研究所

池  永      裕

キリンビール株式会社研究開発部

安  田  武  夫

ライフエンジニアリング株式会社

西  野  賢  貴

東レ株式会社東京本社研究開発企画部

坂  田      衞

株式会社島津製作所東京分析センター計測事業本部

島  田  光太郎

合同酒精株式会社研究開発部

仲      恭  寛

天野製薬株式会社研究開発部

中  島  和  男

宝酒造株式会社バイオインダストリー部

倉  林      肇

住友ベークライト株式会社医療機器事業部

緒田原  蓉  二

株式会社日立製作所システム事業部

(事務局)

吉  村  大  輔

工業技術院標準部繊維化学規格課

山  本  健  一

工業技術院標準部繊維化学規格課


21

K 7001-1990

JIS K 7001

工業用アミラーゼ工業標準改正原案作成委員会(敬称略・順不同)

氏名

所属

◎○

小  巻  利  章

福山大学附属産業科学研究所

貝  沼  圭  二

農林水産省農林水産技術会議事務局

増  田      優

通商産業省基礎産業局バイオインダストリー室

細  川  幹  夫

工業技術院標準部

川  村  杉  生

工業技術院微生物工業技術研究所機能開発部

鈴  木  正  信

通商産業省通商産業検査所化学部

栗  原      力

財団法人化学品検査協会化学標準センター

伊  藤  義  邦

加藤化学株式会社開発部

衣  笠  順  三

鐘紡株式会社加工研究所

吉  栖      肇

サントリー株式会社基礎研究所

松  平  昌  樹

参松工業株式会社

○□

菅  野  智  栄

昭和産業株式会社技術部

三  輪  泰  造

日本食品化工株式会社

○△□

大  矢  隆  一

天野製薬株式会社研究開発本部第二開発部

服  部      惇

三共株式会社化学研究所

○●

小  高  俊  彦

大和化成株式会社研究開発部

○△▲

田  治      襄

ナガセ生化学工業株式会社営業開発部

○▲□

中  川      鍛

ノボ・インダストリージャパン株式会社応用技術部

辻  阪  好  夫

株式会社林原総合研究所

関係者

浦  野  四  郎

工業技術院標準部繊維化学規格課

飯  嶋  啓  子

工業技術院標準部繊維化学規格課

松  本  満  男

通商産業省基礎産業局バイオインダストリー室

事務局

内  田  惠  博

財団法人バイオインダストリー協会

◎  委員長    ○  合同分科会兼任            ●  細菌液化型アミラーゼ分科会兼任

              △  グルコアミラーゼ分科会兼任▲  マルトース生成アミラーゼ分科会兼任
              □  枝切りアミラーゼ(プルラナーゼ)分科会兼任