K 0603 : 2000
(1)
まえがき
この規格は，工業標準化法第 14 条によって準用する第 12 条第 1 項の規定に基づき，財団法人バイオイ
ンダストリー協会 (JBA) ／財団法人日本規格協会 (JSA) から，工業標準原案を具して日本工業規格を改
正すべきとの申出があり，日本工業標準調査会の審議を経て，通商産業大臣が改正した日本工業規格であ
る。これによって JIS K 0603 : 1992 は改正され，この規格に置き換えられる。
日本工業規格
JIS
K
0603
: 2000
免疫グロブリンの定量方法
Proteins
−Immunoglobulin−Methods for quantitative analysis
1.
適用範囲 この規格は，化学製品又は試薬としての免疫グロブリン（以下，グロブリンという。）の品
質を決定するための定量方法について規定する。
2.
引用規格 付表 1 に掲げる規格は，この規格に引用されることによって，この規格の規定の一部を構
成する。これらの引用規格は，その最新版（追補を含む。
）を適用する。
3.
定義 この規格で用いる主な用語の定義は，JIS K 0211 及び JIS K 3600 による。
4.
共通事項 化学分析について共通する一般事項は，JIS K 0050 による。ただし，水は，JIS K 0557 の
4.
（種別及び質）の A4 に規定する蒸留水とする。
5.
定量方法の種類 グロブリンの定量方法の種類は，一括定量法の吸光光度法（ローリー法），分別定量
法の電気泳動−染色デンシトメトリー法及び高速液体クロマトグラフ−紫外吸光検出法とする。
a)
吸光光度法（ローリー法） たん白質と銅イオンの反応で生じたたん白質銅キレート体とたん白質に
よって還元されて生じたりんモリブデン青及びりんタングステン青の吸光度によって定量する。この
方法は 100∼1 000mg/l のたん白質を一括定量することができる。
備考 試料液中にエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム 2.5mmol/l 以上，メルカプトエタノー
ル 15mmol/l 以上，又はドデシル硫酸ナトリウム 0.5mol/l 以上をそれぞれ含むものは定量できな
い。
b)
電気泳動−染色デンシトメトリー法 たん白質を電気泳動によって分画して染色し，その光学濃度に
よって定量する。
1)
酢酸セルロース膜電気泳動 この方法は，100∼1 000mg/l のグロブリンを不純物から分離定量する
ことができる。
備考 試料液中にエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム 0.2mol/l 以上，メルカプトエタノール
0.1mol/l
以上，又はドデシル硫酸ナトリウム 20mmol/l 以上をそれぞれ含むものは定量できない。
2)
SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 この方法は，50∼100mg/l の免疫グロブリンを不純物から
分離定量することができる。
c)
高速液体クロマトグラフ−紫外吸光検出法 たん白質を高速液体クロマトグラフ法によって分画し，
220nm
付近の波長を用いて定量する。この方法は含有成分を分子サイズによって分別し，40∼200mg/l
のグロブリンを定量することができる。
備考 試料液中にエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム 0.2mol/l 以上，メルカプトエタノール
2
K 0603 : 2000
50mmol/l
以上，又はドデシル硫酸ナトリウム 3mmol/l 以上をそれぞれ含むものは定量できない。
6.
グロブリン溶液 グロブリン溶液は，次による。ただし，SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用
のものは，JIS K 3838 の 5.5.3 の(2)（泳動用試料溶液及び泳動用標準たん白質溶液の調製）によって調製
する。
6.1
分析用試料溶液 それぞれの定量方法の定量範囲内に入るよう試料グロブリンの濃度を水で調整す
る。
6.2
検量線用原液 精製グロブリン(
1
)
を水に溶かし 1 000mg/l の溶液を調製する。使用時に調製する。
注(
1
)
プールされた血清又は血しょう（漿）から，Cohn らのエタノール分画法によって得られた画分
を更にクロマトグラフなどによって精製し，凍結乾燥などの処理をしたもの。
7.
吸光光度法
7.1
試薬 試薬は，次による。
a)
アルカリ性硫酸銅酒石酸溶液 次に規定する A 液 50 容と B 液 1 容を混合したもの。使用時に調製す
る。
A
液 JIS K 8576 に規定する水酸化ナトリウム 0.43g，JIS K 8625 に規定する炭酸ナトリウム（無水）
2.0g
を水に溶かして 100ml としたもの。
B
液 JIS K 8983 に規定する硫酸銅 (II) 五水和物 0.5g を酒石酸カリウム溶液 (10g/l)(
2
)
に溶かし，
JIS K 8574
に規定する水酸化カリウムの溶液 (0.5mol/l) で pH6.3 に調整して 100ml としたもの。
注(
2
) JIS K 8535
に規定する (＋) −酒石酸カリウム−水 (2/1) 1g を水に溶かして100ml としたもの。
JIS K 8540
に規定する (＋) −酒石酸ナトリウム二水和物1g を水に溶かして調製したものでも
よい。
b)
フェノール試薬 JIS K 8612 に規定するタングステン (VI) 酸ナトリウム二水和物 100g，JIS K 8906
に規定するモリブデン (VI) 酸ナトリウム 25g を共通すり合わせ丸底フラスコにとり，JIS K 9005 に
規定するりん酸 50ml（約 0.7mol）
，JIS K 8180 に規定する塩酸 100ml（約 1.2mol）及び水 700ml を加
えて，還流冷却下で 10 時間加熱する。これに JIS K 8994 に規定する硫酸リチウム一水和物 150g，水
50ml
及び JIS K 8529 に規定する臭素を数滴加え，15 分間煮沸して過剰の臭素を除き，水を加えて 1l
としたもの。褐色瓶に保存する。フェノールフタレインを指示薬とし，0.1mol/l 水酸化ナトリウム溶
液で滴定を行い，酸濃度が 1mol/l になるように水で調製する(
3
)
。
注(
3
)
約1.9∼2倍の希釈になる。フェノール試薬は，市販品を用いてもよい。
c)
グロブリン溶液 6.による。
7.2
装置及び器具 装置及び器具は，次による。
a)
分光光度計
b)
マイクロピペット JIS K 0970 に規定するもの又はそれと同等以上の性能のもの。
7.3
操作 操作は，次による。
a)
分析用試料溶液 0.1ml を試験管にとり，
アルカリ性硫酸銅酒石酸溶液 2.0ml を加えて 10 分間放置する。
b)
フェノール試薬 0.2ml を加え，よく振り混ぜて 30 分間放置する。
c)
試料を 10mm 吸収セルに移し波長 750nm でその吸光度を測定する。
d) a)
で分析用試料溶液の代わりに水を用い a)及び b)の操作を行ったものを対照液とする。
e)
f)
によって作成した検量線からグロブリンの量を求める(
4
)
。
3
K 0603 : 2000
注(
4
)
データ処理装置で行う場合は，装置に表示された記録又は指示値による。
f)
検量線の作成 検量線原液を用い 0∼1 000mg/l の範囲で段階的濃度(
5
)
の検量線溶液を調製して，これ
から 0.1ml をとり，a)及び b)と同様に操作し，グロブリン量と吸光度との関係線を作成する。
注(
5
) 5
段階程度が一般に用いられる。
備考 操作は 20℃付近で行う。
7.4
計算 試料中のグロブリン純度は，次の式によって算出する。
100
10
3
×
×
×
m
D
m
A
i
＝
ここに，
A
： 試料中のグロブリンの純度 (%)
m
： 試料の質量 (g)
D
： 試料の希釈倍率
m
i
： 検量線から読み取った質量 (mg)
8.
電気泳動−染色デンシトメトリー法
8.1
酢酸セルロース膜電気泳動
8.1.1
試薬 試薬は，次による。
a)
ベロナール緩衝液 5，5−ジエチルバルビツール酸(
6
)
2.2g
，5，5−ジエチルバルビツール酸ナトリウ
ム (
7
)
12.4g
に水約 800ml を加え，80∼90℃の水浴中で溶かし，放冷後，塩酸 (0.1mol/l) で pH8.6 に調
整をし，水を加えて 1 000ml としたもの(
8
)
。
注(
6
)
5
，5−ジエチル−2，4，6 (1H，3H，5H) −ピリミジントリオン
(
7
)
5
，5−ジエチル−2，4，6 (1H，3H，5H) −ピリミジントリオンナトリウム
(
8
)
ベロナール緩衝液は市販品を用いてもよい。
b)
トリクロロ酢酸溶液 JIS K 8667 に規定するトリクロロ酢酸 7g を水に溶かして 100ml としたもの。
c)
脱色液 JIS K 8355 に規定する酢酸 50ml に水を加えて 1 000ml としたもの。
d)
染色液 93ml の水に酢酸 7ml を加え，ブリリアントブルーG−250(
9
)
1g
を溶かしたもの。使用時に JIS
P 3801
に規定するろ紙（2 種）でろ過する。
注(
9
)
C
．I．アシッドブルー90
n
−（4−（
（4−（
（4−エトキシフェニル）アミノ）フェニル）−（4−（エチル（
（3−スルホ
フェニル）メチル）アミノ）−2−メチルフェニル）メチレン−3 メチル−2，5−シクロヘキサ
ジエン−1−イリデン）−N−エチル−3−スルホベンゼンメタナミウムナトリウム
e)
透明化液 デカヒドロナフタレン（デカリン）を用いる。
f)
グロブリン溶液 6.による。
g)
電気泳動用酢酸セルロース膜 長さ 5∼6cm，幅 22∼36cm のもの。
8.1.2
装置及び器具 装置及び器具は，次による。
a)
電気泳動装置 電気泳動装置の構成は，次による。
1)
定電流装置 30mA，200V 程度の出力をもつもの。
2)
泳動槽 空間 1 000cm
3
につき緩衝液面の総面積が膜面積も含めて 200cm
2
以上で，ふた付のもの。
b)
検出予備操作部(
10
)
1)
染色槽 ふた付のもの。
2)
洗浄槽 ふた付のもの 5 個。
4
K 0603 : 2000
3)
透明化液槽 ふた付のもの。
注(
10
)
電気泳動装置に附属するものもある。
c)
デンシトメータ(
10
)
波長 610nm 付近で測定でき，定量範囲内で光学的直線性のあるもの。
d)
針付マイクロピペット又はマイクロシリンジ JIS K 0970 に定めるものなど。
e)
ろ紙 JIS P 3801 の 2 種，角形ろ紙（大判）のもの。
f)
スライドグラス
g)
ピンセット
8.1.3
操作 操作は，次による。
a)
電気泳動用酢酸セルロース膜（以下，膜という。
）をベロナール緩衝液に浮かせ膜の片面から液を均一
に浸み込ませるようにして膜を液中に沈める。膜の取扱いにはピンセットを使用する。次の操作も同
様とする。約 30 秒間放置後，膜を引き上げ，ろ紙の間に膜を挟んで軽く押さえ余分な緩衝液を除き，
泳動槽の支持板の上に気泡が入らないように固定する(
11
)
。
注(
11
)
試料を泳動させる膜の上下に，1cm ほどの補助膜をおくと泳動像がひずむのを防ぐことができ
る。
b)
検量線原液を用い 0∼1 000mg/l の範囲で段階的濃度(
5
)
の検量線溶液を調製して，針付マイクロピペッ
ト又はマイクロシリンジを用い，膜の所定の塗布位置に(
12
)
それぞれ 1
µl を塗る。同様に分析用試料溶
液 1
µl をとり同様に塗る。
注(
12
)
塗布位置及び泳動条件は，使用器材などの状況によって異なるので，膜の製造業者の指定によ
る。
c)
泳動槽のふたをして，
膜幅 1cm 当たり約 0.7mA の定電流で約 45 分間 20℃付近で電気泳動を行う(
12
)
。
d)
膜をトリクロロ酢酸溶液に 5 分間浸した後，染色液に 3 分間浸して染色する。
e)
染色した膜を脱色液約 200ml 中で軽く振とうして洗浄する。この場合脱色液は 5 回程度取り替える。
f)
洗浄した膜をろ紙に挟んで乾かした後(
13
)
透明化液に浸して透明化し，スライドグラスに挟んで波長
610nm
でデンシトメータによって測定する。
注(
13
)
温風乾燥器（約50℃）で約30分間乾燥する。室温で乾燥してもよい。
g)
検量線の作成 a)∼f)の操作を行って得られた検量線用溶液の個々のスポット測定値とグロブリン濃
度との関係線を作成し検量線とする。
8.1.4
計算 試料中のグロブリンの純度は，次の式によって算出する。
100
10
3
×
×
×
m
D
m
A
i
＝
ここに，
A
： 試料中のグロブリンの純度 (%)
m
： 試料の質量 (g)
D
： 試料の希釈倍率
m
i
： 検量線から読み取った質量 (mg)
8.2
SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
8.2.1
試薬 JIS K 3838 の 5.3（試薬）及び 5.4（試薬溶液の調製）による。
8.2.2
装置及び器具 JIS K 3838 の 4.（電気泳動装置）による。
8.2.3
操作 JIS K 3838 の 5.5（操作方法）及び 7.（定量分析）による。
9.
高速液体クロマトグラフ−紫外吸光検出法
5
K 0603 : 2000
9.1
試薬 試薬は，次による。
a)
溶離液 紫外線吸収，溶離方式などを考慮し，カラムを腐食しないような緩衝液を使用する。
b)
グロブリン溶液 6.による。
9.2
装置及び器具 装置及び器具は，次による。
a)
高速液体クロマトグラフ
1)
検出器 紫外分光光度計
2)
カラム用管 ステンレス鋼製，ガラス製など
3)
カラム充てん剤 サイズ排除クロマトグラフ用多孔性親水性ゲル
b)
マイクロシリンジ 容量 25
µl 又は 50µl
9.3
操作 操作は，次による。
a)
分析条件の設定 装置について最適条件を設定する。次にその一例を示す。
1)
カラム充てん剤 排除限界が分子量 5×10
5
程度の多孔性親水性シリカゲル
参考 サイズ排除クロマトグラフ用多孔性親水性ゲルには TSK
gel
G3000SW
XL
などがある。
2)
カラム用管 内径 7.8mm，長さ 30cm ステンレス鋼製
3)
カラム槽温度 20℃付近
4)
溶離液 JIS K 8986 に規定する硫酸ナトリウム十水和物 48.3g，JIS K 9009 に規定するりん酸二水素
ナトリウム二水和物 7.8g を水約 800ml に溶かし，水酸化ナトリウム溶液 (0.1mol/l) で pH7.0 に調整
し，水を加えて 1 000ml とする。
5)
流量 1.0ml/min
6)
試料液量 10
µl
7)
検出波長 220nm
b)
一定量の分析用試料溶液をマイクロシリンジで注入しクロマトグラムを得る。
a)
に示した分析条件例によるクロマトグラムを
図 1 に示す。
6
K 0603 : 2000
図 1 クロマトグラムの一例
c)
クロマトグラムからピーク面積に相当する値を求める。ピーク面積の測定は，JIS K 0124 の 9.3（ピー
ク面積）による。
d)
e)
で作成した検量線からグロブリンの量を求める。
e)
JIS K 0124
の 9.4（絶対検量線法）によって定量する。
f)
検量線原液を用い，40∼200mg/l の範囲で段階的濃度(
5
)
の検量線溶液を調製し，b)及び c)の操作に従い
グロブリン量とピーク面積との関係線を作成する。
9.4
計算 試料中のグロブリンの純度は，次の式によって算出する。
100
10
3
×
×
×
m
D
m
A
i
＝
ここに，
A
： 試料中のグロブリンの濃度 (%)
m
： 試料の質量 (g)
D
： 試料の希釈倍率
m
i
： 検量線から読み取った質量 (mg)
10.
定量結果の表示
10.1
表示項目 表示項目は，次による。
a)
試料名及び試料起源
b)
定量方法の種類及び準拠規格番号
c)
定量値 (%)
10.2
定量値の取扱い 同一試料溶液 2 個について行った平行測定の測定値及びその平均値。
7
K 0603 : 2000
付表 1 引用規格
JIS K 0050
化学分析方法通則
JIS K 0124
高速液体クロマトグラフ分析通則
JIS K 0211
分析化学用語（基礎部門）
JIS K 0557
用水・排水の試験に用いる水
JIS K 0970
プッシュボタン式液体用微量体積計
JIS K 3600
バイオテクノロジー用語
JIS K 3838
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析通則
JIS K 8180
塩酸（試薬）
JIS K 8355
酢酸（試薬）
JIS K 8529
臭素（試薬）
JIS K 8535
(＋) −酒石酸カリウム−水 (2/1) （試薬）
JIS K 8540
(＋) −酒石酸ナトリウム二水和物（試薬）
JIS K 8574
水酸化カリウム（試薬）
JIS K 8576
水酸化ナトリウム（試薬）
JIS K 8612
タングステン (VI) 酸ナトリウム二水和物（試薬）
JIS K 8625
炭酸ナトリウム（試薬）
JIS K 8667
トリクロロ酢酸（試薬）
JIS K 8906
モリブデン (VI) 酸二ナトリウム二水和物（試薬）
JIS K 8983
硫酸銅 (II) 五水和物（試薬）
JIS K 8986
硫酸ナトリウム十水和物（試薬）
JIS K 8994
硫酸リチウム一水和物（試薬）
JIS K 9005
りん酸（試薬）
JIS K 9009
りん酸二水素ナトリウム二水和物（試薬）
JIS P 3801
ろ紙（化学分析用）
関連規格 JIS K 3837 酢酸セルロース膜自動電気泳動装置
8
K 0603 : 2000
JIS K 0603
（免疫グロブリンの定量方法）改正原案作成委員会 構成表
氏名
所属
（委員長）
奥 山 典 生
東京都立大学（名誉教授）
（委員）
石 関 忠 一
横浜国立大学（客員教授）
池 本 卯 典
日本獣医畜産大学
室 塚 剛 志
日本赤十字社 血漿分画センター
鈴 木 正 信
和光純薬工業株式会社 品質・環境管理部
田 中 重 則
生化学工業株式会社 機能化学品事業部
吉 田 基 子
プロテインテクノスインステイチュート 技術部
橋 本 進
財団法人日本規格協会 技術部
松 本 保 輔
財団法人化学物質評価研究機構 化学標準部
大 歳 明
三光純薬株式会社 営業企画二部
立 花 浩 司
シグマアルドリッチジャパン株式会社 試薬事業部
田 中 公 和
ナカライテスク株式会社京都工場 第二製造部
松 本 一 彦
日本たばこ産業株式会社 安全性研究所
（関係者）
川 端 尚 志
通商産業省 生物化学産業課
（事務局）
奥 泉 仁 一
財団法人バイオインダストリー協会
青 木 由 佳
財団法人バイオインダストリー協会
大 内 史 子
財団法人バイオインダストリー協会
（文責 奥山典生，吉田基子）