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日本工業規格

JIS

 K

9809

 : 1996

生化学試薬−D (+) -グルコース

D (

+) -Glucose

C

6

H

12

O

6

  FW : 180.16

1.

適用範囲  この規格は,生化学試薬として用いる D (+) -グルコース(

1

)

について規定する。

(

1

)

別名:ぶどう糖及びデキストロース

備考  この規格の引用規格を,付表 に示す。

2.

共通事項  この規格に共通する事項は,JIS K 8001 及び JIS K 8008 による。

3.

性質  D (+) -グルコースは,次の性質を示す。

(1)

性状  D (+) -グルコースは,白い結晶又は結晶性粉末で,水に溶けやすく,エタノールに溶けにくい。

通常

α

-D (

+) -グルコピラノースで,立体異性体の

β

-D (

+) -グルコピラノースを約 1∼3%含む。水溶

液中では,加水分解によってピラノース環の開いた鎖状異性体を経由して

β

-D (

+) -グルコピラノース

に変異する。20℃では,

α

体,鎖状体,

β

体が質量比 36 : 1 : 63 の平衡状態になる。

(2)

定性方法  試料の赤外吸収スペクトルを JIS K 8008 の 4.1.17(赤外分光光度法による試験法)によっ

て測定すると,波数 3 440cm

1

,2 950cm

1

,1 460cm

1

,1 340cm

1

,1 230cm

1

,1 110cm

1

,1 030cm

1

,920cm

1

,840cm

1

,780cm

1

及び 620cm

1

付近に主な吸収を認める。この場合,試料調製は JIS K 

0117

の 6.2(1)(錠剤法)による。赤外吸収スペクトルの一例を

図 に示す。


 

2

K

 9809 :

 199


図 1    赤外吸収スペクトルの一例


3

K 9809 : 1996

4.

品質  品質は,5.によって試験し,表 に適合しなければならない。

表 1  品質

項目

規格値

純度 99.5%以上

水溶状 (250g/l)

澄明

比旋光度

[ ]

20
D

α

+52.5∼+53.0

乾燥減量 0.2%以下

吸光度 (1mol/l)

228nm

0.03

以下

 260nm

0.02

以下

 280nm

0.02

以下

塩化物 (Cl)

0.002%

以下

硫酸塩 (SO

4

) 0.002%

以下

溶性でんぷん又は亜硫酸塩

試験適合

リチウム (Li)

5ppm

以下

ナトリウム (Na)

0.005%

以下

カリウム (K)

0.005%

以下

銅 (Cu)

5ppm

以下

マグネシウム (Mg)

5ppm

以下

カルシウム (Ca)

0.001%

以下

ストロンチウム (Sr)

5ppm

以下

バリウム (Ba)

5ppm

以下

亜鉛 (Zn)

5ppm

以下

カドミウム (Cd)

5ppm

以下

アルミニウム (Al)

5ppm

以下

ゲルマニウム (Ge)

5ppm

以下

鉛 (Pb)

3ppm

以下

ひ素 (As)

0.2ppm

以下

ビスマス (Bi)

5ppm

以下

セレン (Se)

5ppm

以下

クロム (Cr)

5ppm

以下

モリブデン (Mo)

5ppm

以下

マンガン (Mn)

5ppm

以下

鉄 (Fe)

3ppm

以下

コバルト (Co)

5ppm

以下

ニッケル (Ni)

5ppm

以下

蛍光物質

試験適合

エンドトキシン 3EU/g 以下

その他の糖類 (HPLC)

0.3%

以下

DNA

加水分解酵素

試験適合

5.

試験方法  試験方法は,JIS K 8008 及び JIS K 8001 によるほかは,次のとおりとする。

5.1

水及び標準液

(1)

水  水は,JIS K 8008 の 4.(試験方法)に規定していない場合は,JIS K 8008 の 3.2(水)に規定する

A3

又は A4 のいずれかを用いる。

(2)

標準液の調製

(a)

リチウム標準液 (0.1mgLi/ml)    JIS K 8162 に規定する塩化リチウム 0.611g を全量フラスコ 1 000ml

にはかりとり,水を標線まで加える。

(b)

ナトリウム標準液 (1mgNa/ml),カリウム標準液 (1mgK/ml)    JIS K 8001 の 4.3(2)(原子吸光法,


4

K 9809 : 1996

炎光光度法用)に規定する原液を用いる。

(c)

銅標準液 (0.1mgCu/ml),マグネシウム標準液 (0.1mgMg/ml),カルシウム標準液 (0.1mgCa/ml),ス

トロンチウム標準液 (0.1mgSr/ml),バリウム標準液 (0.1mgBa/ml),亜鉛標準液 (0.1mgZn/ml),カ

ドミウム標準液 (0.1mgCd/ml),アルミニウム標準液 (0.1mgAl/ml),鉛標準液 (0.1mgPb/ml),ビス

マス標準液 (0.1mgBi/ml),クロム標準液 (0.1mgCr/ml),マンガン標準液 (0.1mgMn/ml),鉄標準液 

(0.1mgFe/ml)

,コバルト標準液 (0.1mgCo/ml) 及びニッケル標準液 (0.1mgNi/ml)    JIS K 8001 

4.3(2)

に規定するそれぞれの原液 10ml を全量ピペット 10ml を用いて全量フラスコ 100ml にとり,

水を標線まで加える。

なお,JIS K 0010 に規定する銅標準液の Cu100,JIS K 0011 に規定する亜鉛標準液の Zn100,JIS 

K 0012

に規定するカドミウム標準液の Cd100,JIS K 0013 に規定するニッケル標準液の Ni100,JIS 

K 0014

に規定するコバルト標準液の Co100,JIS K 0015 に規定する鉛標準液の Pb100,JIS K 0016

に規定する鉄標準液の Fe100,JIS K 0017 に規定するビスマス標準液の Bi100,JIS K 0024 に規定す

るクロム標準液の Cr100 及び JIS K 0027 に規定するマンガン標準液の Mn100 を用いてもよい。

(d)

ゲルマニウム標準液 (0.1mgGe/ml)   酸化ゲルマニウム(純度 99.9%以上のもの)0.144g をポリエ

チレン製三角フラスコ 50ml にはかりとり,JIS K 8576 に規定する水酸化ナトリウム 1g 及び水 20ml

を加えて振り混ぜながら必要ならば温めて溶かし,常温になるまで冷却した後,全量フラスコ 1

000ml

に入れ,さらに,三角フラスコに残った液を水で洗い入れた後,水を標線まで加える。

(e)

ひ素標準液 (0.001mgAs/ml)    JIS K 8001 の 4.3(2)に規定する原液 25ml を全量ピペット 25ml を用い

て全量フラスコ 250ml にとり,水を標線まで加える。その 10ml を全量ピペット 10ml を用いて全量

フラスコ 1 000ml にとり,水を標線まで加える。

なお,JIS K 0026 に規定するひ素標準液の As 1 を用いてもよい。

(f)

セレン標準液 (0.1mgSe/ml)    JIS K 8598 に規定するセレン 0.100g をガラス製三角フラスコ 50ml

にはかりとり,JIS K 8001 の 4.1(希釈溶液)に準じて調製した硝酸 (1+1) 20ml を加えて振り混ぜ

ながら加熱して溶かし,

煮沸して窒素酸化物を追い出し,

常温まで冷却した後,

全量フラスコ 1 000ml

に入れ,さらに,三角フラスコに残った液を水で洗い入れた後,水を標線まで加える。

(g)

モリブデン標準液 (0.1mgMo/ml)    JIS K 8905 に規定する七モリブデン酸六アンモニウム四水和物

0.184g

を全量フラスコ 1 000ml にはかりとり,水を標線まで加える。

5.2

試験  試験は次による。

(1)

純度  純度の試験は,まず,(4)乾燥減量及び(33)その他の糖類 (HPLC)  の試験を行い,乾燥減量の測

定値及びその他の糖類の定量値から次の計算式によって算出する。

(1.1)

計算式

A

=100−

÷

ø

ö

ç

è

æ

+

×

W

W

I

100

100

ここに,

A

純度

 (%)

I

5.2(33)

で求めたその他の糖類

 (%)

W

5.2(4)

で求めた乾燥減量

 (%)

(2)

水溶状  水溶状の試験は,JIS K 8001 の 5.2(溶状)によって行う。

(2.1)

操作  操作は,次のとおりとする。

(a)

試料

5g

をはかりとり,水を加えて

20ml

にする。

(3)

比旋光度

[ ]

20
D

α

  比旋光度の試験は,JIS K 0063 によって行う。


5

K 9809 : 1996

(3.1)

操作  操作は,次のとおりとする。

(a)

試料

10g

0.1mg

のけたまではかりとり,全量フラスコ

100ml

に入れ,アンモニア水

 (2

3) 0.2ml

及び水

80ml

を加えて溶かし,

20

℃で

1

時間放置後,水を標線まで加えて試料溶液とする。

(b)

試料溶液を

100mm

セルを用い,

20

±

0.5

℃で旋光度を測定する。

(c)

別に求めた乾燥減量値から次の式によって比旋光度を求める。

[ ]

100

100

100

20

W

S

D

×

×

=

α

α

ここに,

[

α

]

20
D

測定温度 20℃,測定波長ナトリウムの D 線 
(589.3nm)

における比旋光度

α

測定した旋光度

S

試料の質量 (g)

W

5.2(4)

で求めた乾燥減量 (%)

(4)

乾燥減量  乾燥減量の試験は,JIS K 0067 の 4.1.1(1)(第 1 法  大気圧下で加熱乾燥する方法)によっ

て行う。

(4.1)

操作  操作は,次のとおりとする。

(a)

試料約 1.0g を 0.1mg のけたまではかりとり,105℃で 6 時間乾燥し減量を求める。

(5)

吸光度 (1mol/l)    吸光度の試験は分光光度計を用い,JIS K 8008 の 4.1.4(吸光光度法による試験法)

によって行う。

(5.1)

操作  操作は,次のとおりとする。

(a)

試料 18.02g をはかりとり,全量フラスコ 100ml に入れ,水を標線まで加えて,試料溶液とする。

(b)

試料溶液を,次の装置操作条件で吸光度の試験を行う。

装置操作条件

波長

:228nm,260nm,280nm

光源

:重水素ランプ

吸収セル

:光路長 10mm,石英ガラス製

(6)

塩化物 (Cl)   塩化物 (Cl) の試験は,JIS K 8001 の 5.7[塩化物 (Cl)](1)(比濁法)によって行う。

(6.1)

試料側溶液及び標準側溶液の調製

(a)

試料側溶液  試料 1.0g を水に溶かして 20ml にする。

(b)

標準側溶液  塩化物標準液 (0.01mgCl/ml) 2.0ml をとり,水を加えて 20ml にする。

(6.2)

操作  試料側溶液及び標準側溶液それぞれに,硝酸 (1+2) 5ml 及び硝酸銀溶液 (20g/l) 1ml を加え振

り混ぜた後,15 分間放置する。

(6.3)

判定  試料側の濁りは,標準側の白濁より濃くない。

(7)

硫酸塩 (SO

4

)

  硫酸塩 (SO

4

)

の試験は,JIS K 8001 の 5.15(硫酸塩)(1)(比濁法)によって行う。

(7.1)

試料側溶液及び標準側溶液の調製

(a)

試料側溶液  試料 5.0g をとり,塩酸 (2+1) 0.3m1 及び水を加えて溶かし 25ml にする。

(b)

標準側溶液  硫酸塩標準液 (0.01mgSO

4

/ml) 10ml

をとり,塩酸 (2+1) 0.3m1 及び水を加えて 25ml

にする。

(7.2)

操作  試料側溶液,標準側溶液それぞれにエタノール (95) 3ml 及び塩化バリウム溶液 (100g/l) 2ml

を加えて振り混ぜた後,30 分間放置する。

(7.3)

判定  試料側の濁りは,標準側の濁りより濃くない。


6

K 9809 : 1996

(8)

溶性でんぷん又は亜硫酸塩  溶性でんぷん又は亜硫酸塩の試験は,次による。

(8.1)

試薬の調製

(a)

よう素溶液  JIS K 8920 に規定するよう素 14g をよう化カリウム溶液(40g+水→100ml)100ml に

溶かし,塩酸(23.6ml+水→100ml)1m1 及び水を加えて 1 000ml とする。

(8.2)

試料溶液  試料 1.0g に水を加えて 10ml にする。

(8.3)

操作  試料溶液によう素溶液 1 滴を加える。

(8.4)

判定  試料溶液は,黄色となる。

(9)

リチウム (Li)   リチウムの試験は,次のとおり行う。

(9.1)

試料側溶液の調製  試料 50.0 g を全量フラスコ 200ml にはかりとり,水を標線まで加える。これを

S

液とする。

S

液 40ml(試料の量 10.0g)を全量フラスコ 100ml (A)  に全量ピペット 40ml を用いてとり,さら

に,JIS K 8001 の 4.1 に準じて調製した塩酸 (1+1) 3ml を加えて振り混ぜた後,水を標線まで加え

る。

(9.2)

標準側溶液の調製  S 液 40ml(試料の量 10.0 g)を 3 個の全量フラスコ 100ml(B,C 及び D)に全

量 ピ ペッ ト 40ml を 用 い て と り, さ ら に , リチ ウ ム 標 準液 (0.1mgLi/ml) , ナ ト リウ ム 標 準液

(1mgNa/ml)

,カリウム標準液 (1mgK/ml) をメスピペットを用いて 0.25ml を全量フラスコ B に,全

量ピペット 0.5ml を用いて全量フラスコ C に,全量ピペット 1ml を用いて全量フラスコ D にそれぞ

れとり,さらに,JIS K 8001 の 4.1 に準じて調製した塩酸 (1+1) 3ml ずつを加えて振り混ぜた後,

水を標線まで加える。

なお,この試料側溶液及び標準側溶液は,(10)及び(11)の試験にも用いる。

(9.3)

操作  操作は(9.1)の試料側溶液及び(9.2)の標準側溶液を用い,JIS K 8008 の 4.1.7(フレーム原子吸

光法による試験法)に従い,定量は JIS K 0121 の 7.1(2)(標準添加法)による。この場合,測定波

長は,670.7nm とする。

なお,この操作は(10)及び(11)の試験にも適用する。ただし,測定波長は,それぞれの試験方法で

規定したものとする。

(10)

ナトリウム (Na)   ナトリウムの試験は,(9)による。この場合,測定波長は,589.0nm とする。

(11)

カリウム (K)   カリウムの試験は,(9)による。この場合,測定波長は,766.5nm とする。

(12)

 (Cu)   銅の試験は,次のとおり行う。

(12.1)

試料側溶液の調製  試料 50.0g を全量フラスコ 200ml にはかりとり,水を標線まで加える。これを

S

液とする。

S

液 40ml(試料の量 10.0g)を全量フラスコ 100ml (A)  に全量ピペット 40ml を用いてとり,さら

に,JIS K 8001 の 4.1 に準じて調製した塩酸 (1+1) 3ml を加えて振り混ぜた後,水を標線まで加え

る。

(12.2)

標準側溶液の調製  S 液 40ml(試料の量 10.0 g)を 3 個の全量フラスコ 100ml(B,C 及び D)に全

量ピペット 40ml を用いてとり,

さらに,

銅標準液 (0.1mgCu/ml),

マグネシウム標準液 (0.1mgMg/ml),

ストロンチウム標準液 (0.1mgSr/ml),バリウム標準液 (0.1mgBa/ml),亜鉛標準液 (0.1mgZn/ml),カ

ド ミ ウ ム 標 準 液  (0.1mgCd/ml) , ア ル ミ ニ ウ ム 標 準 液  (0.1mgAl/ml) , ゲ ル マ ニ ウ ム 標 準 液

(0.1mgGe/ml)

, ビ ス マ ス 標 準 液  (0.1mgBi/ml) , セ レ ン 標 準 液  (0.1mgSe/ml) , ク ロ ム 標 準 液

(0.1mgCr/ml)

,モリブデン標準液 (0.1mgMo/ml),マンガン標準液 (0.1mgMn/ml),コバルト標準液

(0.1mgCo/ml)

ニッケル標準液 (0.1mgNi/ml) をメスピペットを用いて 0.25ml を全量フラスコ B に,


7

K 9809 : 1996

全量ピペット 0.5ml を用いて全量フラスコ C に,全量ピペット 1ml を用いて全量フラスコ D にそれ

ぞれとり,カルシウム標準液 (0.1mgCa/ml) を全量ピペット 0.5ml を用いて全量フラスコ B に,全

量ピペット 1ml を用いて全量フラスコ C に,全量ピペット 2ml を用いて全量フラスコ D にとり,鉛

標準液 (0.1mgPb/ml),

鉄標準液 (0.1mgFe/ml) をメスピペットを用いて 0.15ml を全量フラスコ B に,

メスピペットを用いて 0.3ml を全量フラスコ C に,メスピペットを用いて 0.6ml を全量フラスコ D

にそれぞれとり,ひ素標準液 (0.001mgAs/ml) を全量ピペット 1ml を用いて全量フラスコ B に,全

量ピペット 2ml を用いて全量フラスコ C に,全量ピペット 3ml を用いて全量フラスコ D にそれぞれ

とり,さらに,JIS K 8001 の 4.1 に準じて調製した塩酸 (1+1) 3ml ずつを加えて振り混ぜた後,水

を標線まで加える。

なお,この試料側溶液及び標準側溶液は,(13)(30)の試験にも用いる。

(12.3)

操作  操作は(12.1)の試料側溶液及び(12.2)の標準側溶液を用い,JIS K 8008 の 4.1.8[誘導結合プラ

ズマ発光分光分析法(ICP 分析法)による試験法]の(3)(操作)に従い,JIS K 0116 の 9.2.1(3)(標

準添加法)による。この場合,測定波長は,324.754nm とする。

なお,この操作は(13)(30)にも適用する。ただし,測定波長は,それぞれの試験方法で規定した

ものとする。

(13)

マグネシウム (Mg)   マグネシウムの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,279.553nm とす

る。

(14)

カルシウム (Ca)   カルシウムの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,393.366nm とする。

(15)

ストロンチウム (Sr)   ストロンチウムの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,407.771nm と

する。

(16)

バリウム (Ba)   バリウムの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,455.403nm とする。

(17)

亜鉛 (Zn)   亜鉛の試験は,(12)による。この場合,測定波長は,213.856nm とする。

(18)

カドミウム (Cd)   カドミウムの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,228.802nm とする。

(19)

アルミニウム (Al)   アルミニウムの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,396.152nm とする。

(20)

ゲルマニウム (Ge)   ゲルマニウムの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,265.118nm とする。

(21)

 (Pb)   鉛の試験は,(12)による。この場合,測定波長は,220.353nm とする。

(22)

ひ素 (As)   ひ素の試験は,(12)による。この場合,測定波長は,193.696nm とする。

(23)

ビスマス (Bi)   ビスマスの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,206.170nm とする。

(24)

セレン (Se)   セレンの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,196.026nm とする。

(25)

クロム (Cr)   クロムの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,267.716nm とする。

(26)

モリブデン (Mo)   モリブデンの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,379.825nm とする。

(27)

マンガン (Mn)   マンガンの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,257.610nm とする。

(28)

 (Fe)   鉄の試験は,(12)による。この場合,測定波長は,259.940nm とする。

(29)

コバルト (Co)   コバルトの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,238.892nm とする。

(30)

ニッケル (Ni)   ニッケルの試験は,(12)による。この場合,測定波長は,221.647nm とする。

(31)

蛍光物質  蛍光物質の試験は,JIS K 8008 の 4.1.13(蛍光光度法による試験法)によるほかは,次の

とおり行う。

(31.1)

試薬及び標準液の調製

(31.1.1)

硫酸 (0.05mol/l)    水 1に JIS K 8951 に規定する硫酸 3ml を加える。

(31.1.2)

硫酸キニーネ標準液 (10ng/ml)


8

K 9809 : 1996

(a)

硫酸キニーネ(

2

)

50.0mg

を全量フラスコ 500ml にはかりとり,(31.1.1)に規定する硫酸 (0.05mol/l)

100ml

を加えて,振り混ぜて溶かした後,標線まで硫酸 (0.05mol/l)  を加える。この溶液は使用時に

調製する。

(

2

)

硫酸キニーネ二水和物[純度(乾燥後)98.0%以上のもの]を105℃で3時間乾燥して用いる。

(b)

  (a)

の 2.5ml を全量フラスコ 250ml に入れ,標線まで硫酸 (0.05mol/l)  を加える。

(c)

  (b)

の 2.5ml を全量フラスコ 250ml に入れ,標線まで硫酸 (0.05mol/l)  を加える。

(31.2)

試料溶液の調製  試料溶液の調製は,次のとおりとする。

試料 18.016g を全量フラスコ 100ml にはかりとり,水を加えて溶かした後,標線まで水を加える。

(31.3)

操作  操作は,次のとおりとする。

(a)

分光蛍光光度計の励起光側波長を 352nm,スリット幅を 5nm,蛍光側波長を 456nm,スリット幅を

5nm

に設定する。

(b)

光源シャッターを閉じてゼロ合わせを行う。

(c)

蛍光セルに硫酸キニーネ標準液を入れ,分光蛍光光度計にセットする。

(d)

光源シャッターを開き,蛍光強度の最大値が 100%になるように調節する。

(e)

試料溶液を蛍光セルに入れ,分光蛍光光度計にセットする。

(f)

励起光側波長だけを 253nm に設定する。

(g)

蛍光スペクトルを測定する。

(31.4)

判定  蛍光スペクトルのピークのうち,散乱光,ラマン光などのピークを除いた残りのピークの最

大蛍光強度がフルスケール値 100 より大きくない。

(32)

エンドトキシン  エンドトキシンの試験は,JIS K 8008 の 4.3.2(比濁時間分析法)又は 4.3.3(発色合

成基質法)のいずれかによる。

(32.1)

比濁時間分析法による試験  比濁時間分析法による試験は,JIS K 8008 の 4.3.2 によるほかは,次の

とおりとする。

(32.1.1)

水,試薬,溶液,緩衝液及び標準液  水,試薬,溶液,緩衝液及び標準液は JIS K 8008 の 4.3.1(1)

(水)

(2)(試薬,溶液及び緩衝液)及び(3)(標準物質及び標準液)によるほかは,次のとおりと

する。

(a)

試料溶液の調製  試料溶液の調製は,JIS K 8008 の 4.3.1(5)(試料溶液の調製)(a)(固体試料)に

よる。この場合,試料 0.50g を全量フラスコ 50ml にはかりとる。

(b)

標準液の調製  標準液の調製は,JIS K 8008 の 4.3.1(3)(d)(エンドトキシン標準液)の表 5[エンド

トキシン標準液の調製(希釈系列の一例)

]の G,H,I 及び J 標準液の調製法による。

(32.1.2)

本試験  本試験は,JIS K 8008 の 4.3.2(4)(本試験)による。

(32.1.3)

予備試験  予備試験は,JIS K 8008 の 4.3.3(5.1)(試験精度の確認試験),(5.2)[(1→3) -

β

-D-

グル

カン含有の有無に関する確認試験]及び(5.3)(阻害又は促進作用の確認試験)による。

備考  JIS K 8008 の 4.3.2(5.3)による試験において阻害又は促進作用を認めた場合には,最大有効希釈

を超えない範囲で試料溶液を希釈して本試験及び予備試験を行う。

なお,試料溶液を希釈した場合には,(32.1.1)(b)によって調製した G,H,I 及び J 標準液を同

じ倍率で希釈して用いる。

(32.2)

発色合成基質法による試験  発色合成基質法による試験は,JIS K 8008 の 4.3.3 によるほかは,次の

とおりとする。

(32.2.1)

水,試薬,溶液,緩衝液及び標準液  水,試薬,溶液,緩衝液及び標準液は,JIS K 8008 の 4.3.1(1)


9

K 9809 : 1996

(2)

及び(3)によるほかは,次のとおりとする。

(a)

試料溶液の調製  試料溶液の調製は,(32.1.1)(a)による。

(b)

標準液の調製  標準液の調製は,(32.1.1)(b)による。

(c)

反応停止液  反応停止液は,JIS K 8008 の 4.3.3 (1)(f)(反応停止液)による。この場合,酢酸の

濃度は酢酸 (48g/l)  とする。

(32.2.2)

本試験  本試験は,JIS K 8008 の 4.3.3(4)(本試験)による。

この場合,37±0.5℃の恒温槽中で 30 分間放置した後,反応停止液をそれぞれ 0.4ml ずつ加える。

(32.2.3)

予備試験  予備試験は,JIS K 8008 の 4.3.3(5.1)(試験精度の確認試験),(5.2)[(1→3) -

β

-D-

グル

カン含有の有無に関する確認試験]及び(5.3)(阻害又は促進作用の確認試験)による。反応停止液

の添加量は(32.2.2)による。

備考  JIS K 8008 の 4.3.3(5.3)による試験において阻害又は促進作用を認めた場合には,最大有効希釈

を超えない範囲で試料溶液を希釈して本試験及び予備試験を行う。

なお,試料溶液を希釈した場合には,(32.2.1)(b)によって調製した G,H,I 及び J 標準液を同

じ倍率で希釈して用いる。

(33)

その他の糖類 (HPLC)   その他の糖類の試験は,JIS K 0124 に規定する高速液体クロマトグラフ分析

通則によるほかは,次のとおりとする。

(33.1)

分析成分  D (+) -グルコース以外の糖類不純物

(33.2)

試薬

(a)

溶離液:糖類のイオン交換クロマトグラフィーに適するもの。

一例を示す。

A

液:JIS K 8863 に規定するほう酸 9.3g と JIS K 8576 に規定する水酸化ナトリウムで調製した水

酸化ナトリウム溶液 (1mol/l) 10.0ml を水に溶解して 1としたもの。

B

液:JIS K 8863 に規定するほう酸 21.7g と JIS K 8576 に規定する水酸化ナトリウム 6g を水に溶

解して 1としたもの。

(b)

反応液:還元糖を蛍光検出するための試薬とする。

一例を示す。

フェニルヒドラジン・りん酸溶液  純度 99.0%異状のフェニルヒドラジン 6ml を JIS K 8355 に規

定する酢酸 180ml に溶かした後,JIS K 9005 に規定するりん酸 200ml を加える。

備考1.  フェニルヒドラジンは自然発火性があり,また,毒性があるので取扱いに注意する。

2.

反応液には,シアノアセトアミド溶液,アルギニン/ほう酸溶液などがある。

(c)

糖類混合標準液:純度 99%以上の D (+) -ガラクトース,純度 99%以上の D (+) -グルコース,純度

99%

以上のスクロース及びそれらと同じか又はそれ以上の品質の各種の糖類をそれぞれの濃度が

0.1g/1l

になるように全量フラスコ 100ml にはかり入れ,水を標線まで加える。

(33.3)

装置及び器具

(33.3.1)

高速液体クロマトグラフ (HPLC)

(a)

検出器:蛍光光度計で波長選択できるものを用い,(33.2)(c)の糖類混合標準液を 20

µl 注入し,SN 比

100

以上が得られるもの。

(b)

カラム用管の内径及び長さ:十分な強度をもち,内面が平滑で不活性な管で内径 4∼6mm,長さ 15

∼25cm のもの。

(c)

カラム充てん剤:高架橋度スチレン−ジビニルベンゼン共重合体の担体に第 4 級アンモニウム基を


10

K 9809 : 1996

化学的に結合させた充てん剤(粒径 5∼10

µm)。

(d)

グラジェント装置:あらかじめプログラミングができるもの。

(e)

反応液送液ポンプ:脈流の無視できるもの。

(f)

反応槽:反応管は,コイル状で内径 0.5∼0.8mm で,長さ 5∼10m,かつ,150℃まで加熱したとき,

耐熱性を有するもの。反応槽は 150℃まで加熱できるもの。

(g)

記録部:あらかじめ各成分の濃度を入力し,糖類混合標準液を測定すれば相対補正係数を算出し,

測定結果を濃度表示でき,また,バックグランドを差し引けるデータ処理が行えるもの。

(33.3.2)

シリンジ:25

µl マイクロシリンジ,ただし,自動試料導入装置を用いる場合は不要である。

(33.4)

分析条件:分析条件は装置や用いるカラムによって異なるので,各装置又はカラムについて最適条

件を設定しなければならない。次にその一例を示す。

(a)

カラム温度  50℃

(b)

溶離液流量  0.5ml/min

(c)

グラジェント溶離の条件  グラジェント溶離の条件を表 に示す。

表 2  グラジェント溶離の条件

時間(分)

A

液  % B 液  %

 0.0

100

  0

20.0

 20

 80

30.0

 20

 80

42.0

  0

100

42.2

100

  0

70.0

100

  0

(d)

反応液流量  0.5ml/min

(e)

反応槽温度  150℃

(f)

蛍光検出条件  励起波長  330nm

蛍光波長  470nm

備考  この条件の特長は,グルコースが最後に溶出するのでグルコース中の不純物分析に有利である。

しかし,溶離液が弱アルカリ性のため,イオン交換分離の過程でグルコースからフルクトース

を生成するおそれがある。

(33.5)

操作

(33.5.1)

準備

(a)

  HPLC

の条件設定  HPLC を作動させ,カラム温度,溶離液流量,反応液流量,反応槽温度を設定

する。

(b)

溶離条件プログラミング  グラジェント溶離の条件を装置に入力する。

(c)

測定用試料溶液の調製  試料水溶液 (3g/l)  を孔径 0.45

µm のろ過膜でろ過したものを,測定用試料

溶液とする(調製後,2 日以内に測定すること。

(d)

検量線等の作成  データ処理を用いる場合は,まず,糖類混合標準液を 20

µl 導入し,クロマトグラ

ムを描き各成分の保持時間を求める。次に,各成分の名称,保持時間と同定のための変動幅,及び

糖類混合標準液中の各成分の濃度を入力して,再計算機能によって相対補性係数を算出させる。

データ処理装置を用いない場合は,JIS K 0124 の 9.4(絶対検量線法)に規定する方法で検量線を

作成する。

(33.5.2)

定量


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K 9809 : 1996

(a)

測定用試料溶液を装置に 20

µl 導入し,グラジェント溶離を開始する。

(b)

得られたクロマトグラムからグルコースと目的成分のピーク面積比を求める。

(c)

あらかじめ求めてある相対補正係数 を乗じて不純物濃度 を算出する。

c (%)

=100×f×A

s

/A

g

ここに,  A

s

は不純物の,また,A

g

は 1g/以下の濃度で測定し,3g/に調

製された試料濃度に換算したグルコースのピーク面積である。

(d)

データ処理装置を用いない場合は,JIS K 0124 の 9.4 によって各不純物濃度 を算出する。

(33.6)

クロマトグラムの一例  (33.4)に示した分析条件例を適用した場合のクロマトグラムの例を図 

(a)

及び(b)に示す。(a)はグルコースに各糖成分を 0.1%含有させた試料溶液(グルコース 3g/l)を 20

µl

導入したもの,(b)は試料溶液 (3g/l)  を 20

µl 導入したものである。図 2(b)のクロマトグラムはグル

コース中にマルトース 0.08%,イソマルトース 0.06%が不純物として含まれていることを示してい

る。


12

K 9809 : 1996

図 2  クロマトグラムの例

(34)

 DNA

加水分解酵素  DNA 加水分解酵素の試験は,次による。

(34.1)

共通事項  DNA 加水分解酵素の試験に用いる試薬,水及び溶液に接する器具は JIS K 8008 の 3.8(1)

表 の高圧蒸気法(121℃,20 分間)又は照射法(放射線法など)によって滅菌したものを用い

る。

(34.2)

試薬

(a)

りん酸カリウム緩衝液 (1mol/l) (pH6.5)    IS K 9007 に規定するりん酸二水素カリウム(pH 測定用)

を 110℃で 5 時間乾燥したもの 13.60g を水に溶かし,全量フラスコ 100ml に移し入れ,水を標線ま

で加えたもの(A 液)の 50ml に,JIS K 9017 に規定するりん酸水素二カリウムを 110℃で 5 時間乾


13

K 9809 : 1996

燥したもの 17.42g を水に溶かし,全量フラスコ 100ml に移し入れ,水を標線まで加えたもの(B 液)

の 25ml を混合し,25±1℃に調節した恒温水槽中に 10 分間放置後,さらに B 液を加えて JIS Z 8802

に規定する pH 計形式 II を用いて pH6.5 に調整する。

(b)

塩化マグネシウム溶液 (1mol/l)    JIS K 8159 に規定する塩化マグネシウム六水和物 20.33g に水

80ml

を加えて溶かし,全量フラスコ 100ml に移し入れ,水を標線まで加える。

(c)

  2-

メルカプトエタノール溶液 (1mol/l)    純度 99%以上のもの 7.8g を全量フラスコ 100ml にはかり

とり,水を標線まで加える。

(d)

φ

X174DNA RFI

溶液  Covalently Closed Circular Form I (RFI)  を 70%以上含む DNA である

φ

X174

を,

TE

緩衝液(

3

)

に溶かしたもの。

(

3

)

  TE

緩衝液  次の C 液と D 液を用いて調製する。JIS K 9704に規定する2-アミノ-2-ヒドロキシ

メチル-1,3-プロパンジオール12.11g をビーカー100ml にはかりとり,水80ml を加えて溶かした

後 JIS K 80014.1に準じて調製した塩酸 (2+1)  を加えて pH 計形式 II を用いて pH8.0に調整し,

全量フラスコ100ml に移し入れ,さらに水を標線まで加える(C 液)

JIS K 8107

に規定するエチレンジアミン四酢酸二水素ナトリウム二水和物 18.61g をビーカー

100ml

にはかりとり,水 80ml を加えて溶かした後,水酸化ナトリウム溶液 (10g/l)  を加えて pH

計形式 II を用いて pH8.0 に調整し,全量フラスコ 100ml に移し入れ,さらに水を標線まで加え

る(D 液)

C

液 100

µl,D 液 20µl を全量フラスコ 10ml にはかりとり,水を標線まで加える。

参考

φ

X174 DNA RFI

溶液の市販品として

φ

X174 DNA RFI

の一定量を TE 緩衝液に溶かし,その濃度

を表示したものがある。

(e)

水酸化ナトリウム溶液 (10g/l)    JIS K 8576 に規定する水酸化ナトリウム 1g をビーカー100ml にと

り,水 10ml を加えて溶かす。

(f)

  TBE

緩衝液  JIS K 9704 に規定する 2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール 1.08g,JIS 

K 8863

に規定するほう酸 0.55g 及びエチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物 0.07g を

全量フラスコ 100ml にはかりとり,水を標線まで加える。

(g)

  DNA

加水分解酵素溶液  DNA 加水分解酵素  (EC3.1.21.1)  を酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5.2) (

4

)

で希

釈して 0.005U/

µl とする。

(

4

)

酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5.2)    JIS K 8371に規定する酢酸ナトリウム三水和物13.60g をビー

カー100ml にはかりとり,水80ml を加えて溶かし,JIS K 8355に規定する酢酸を加え,pH 計形

式 II を用いて pH5.2に調整し,全量フラスコ100ml に移し入れ,さらに水を標線まで加える。

参考 DNA 加水分解酵素の市販品として DEOXYRIBONUCLEASE 1 TYPE II などがある。

(h)

エチジウムブロミド溶液 (1g/l)    純度 90%以上のエチジウムブロミド 0.1g を全量フラスコ 100ml

にはかりとり,水を標線まで加える。

備考  エチジウムブロミドは,変異原性があるとされているので,取り扱う際には,ゴム手袋を用い

るなど十分な注意が必要である。

(i)

反応停止液  純度 98%以上のドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 0.1g 及び JIS K 8844 に規定するブロ

モフェノールブルー2mg を全量フラスコ 10ml にとり,JIS K 8295 に規定するグリセリンを全量ピ

ペット 5ml を用いて,全量フラスコに加え,さらに水を標線まで加える。

(j)

アガロースゲル (10g/l)    核酸電気泳動用アガロース 3g に(f)の TBE 緩衝液 300ml を加え溶かす。

この溶液に(h)のエチジウムブロミド溶液 (1g/l) 300

µl を加え,ゲル作成板に流して調製する。


14

K 9809 : 1996

参考  核酸電気泳動用アガロースの市販品として AGAROSE TYPE II : Medium EEO などがある。

(34.3)

試料溶液  試料 2.0g を全量フラスコ 10ml にはかりとり,水を標線まで加える。

(34.4)

装置及び器具  装置及び器具は,JIS K 8008 に規定するほか,次のとおりとする。

(a)

平板アガロースゲル電気泳動装置  サブマリン形電気泳動装置とする。

(b)

紫外線ランプ  254nm の輝光をもつもの。

(c)

カメラ及びフィルム

(d)

恒温水槽  37±1℃に保持できるもの。

(e)

反応容器  滅菌したマイクロチューブ (1.5ml)

(f)

プッシュボタン式液体用微量体積計  JIS K 0970 に規定するもの。

(34.5)

操作  操作は,次のとおりとする。

(a)

プッシュボタン式液体用微量体積計を用いて,りん酸カリウム緩衝液 (1mol/l) (pH6.5) 67

µl,塩化マ

グネシウム溶液 (1mol/l) 6.7

µl,2-メルカプトエタノール溶液 (1mol/l) 1µl 及び

φ

X174 DNA RFI20

µg

相当量をとり,水を加えて 1 000

µl の基質溶液を調製する。

(b)

プッシュボタン式液体用微量体積計を用いて,

(a)

の基質溶液 50

µl ずつを滅菌した 3 本の反応容器(A,

B

及び C)にはかりとる。

(c)

プッシュボタン式液体用微量体積計を用いて,(34.3)の試料溶液 50

µl を反応容器 A に加える。

(d)

プッシュボタン式液体用微量体積計を用いて,水 50

µl を反応容器 B に加える。

(e)

プッシュボタン式液体用微量体積計を用いて,水 48

µl 及び DNA 加水分解酵素溶液(0.005U/µl)2µl

を反応容器 C に加える。

(f)

反応容器 A,B 及び C を 37±1℃に調節した恒温水槽に入れ,1 時間放置する。

(g)

反応容器 A,B 及び C を恒温水槽から取り出し,それぞれに(34.2)(i)の反応停止液 5

µl ずつを加え,

電気泳動用試料溶液とする。

(h)

アガロースゲル (10g/l)  の板上に反応容器 A,B 及び C の電気泳動用試料溶液 10

µl ずつを添加し,

電気泳動を行う。

(i)

泳動距離(原点からブロモフェノールブルーの泳動した位置)が約 5cm になるまで泳動する。

(j)

泳動後,ゲルを紫外線ランプで照射して,肉眼で観察する(

5

)

(

5

)

電気泳動の結果を保存する場合には,写真を撮る。

(34.6)

判定  判定は,反応容器 A と反応容器 B の電気泳動用試料溶液の電気泳動のバンドが一致し,反応

容器 A と反応容器 C の電気泳動用試料溶液のバンドが異なるとき,試験適合とする。

6.

容器  容器は,気密容器とする。

7.

表示  表示は,容器に次のことを表示又は添付する。

(1)

名称  生化学試薬−D (+) -グルコース

(2)

化学式及び式量

(3)

品質(純度,エンドトキシン及び DNA 加水分解酵素)

(4)

内容量

(5)

製造番号

(6)

製造年月

(7)

製造業者名又は販売業者名


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K 9809 : 1996

付表 1  引用規格

JIS K 0010

  銅標準液

JIS K 0011

  亜鉛標準液

JIS K 0012

  カドミウム標準液

JIS K 0013

  ニッケル標準液

JIS K 0014

  コバルト標準液

JIS K 0015

  鉛標準液

JIS K 0016

  鉄標準液

JIS K 0017

  ビスマス標準液

JIS K 0024

  クロム標準液

JIS K 0026

  ひ素標準液

JIS K 0027

  マンガン標準液

JIS K 0063

  化学製品の旋光度測定方法

JIS K 0067

  化学製品の減量及び残分試験方法

JIS K 0116

  発光分光分析通則

JIS K 0117

  赤外分光分析方法通則

JIS K 0121

  原子吸光分析通則

JIS K 0124

  高速液体クロマトグラフ分析通則

JIS K 0970

  プッシュボタン式液体用微量体積計

JIS K 8001

  試薬試験方法通則

JIS K 8008

  生化学試薬通則

JIS K 8107

  エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物(試薬)

JIS K 8159

  塩化マグネシウム六水和物(試薬)

JIS K 8162

  塩化リチウム(試薬)

JIS K 8295

  グリセリン(試薬)

JIS K 8355

  酢酸(試薬)

JIS K 8371

  酢酸ナトリウム三水和物(試薬)

JIS K 8576

  水酸化ナトリウム(試薬)

JIS K 8598

  セレン(試薬)

JIS K 8844

  ブロモフェノールブルー(試薬)

JIS K 8863

  ほう酸(試薬)

JIS K 8905

  七モリブデン酸六アンモニウム四水和物(試薬)

JIS K 8920

  よう素(試薬)

JIS K 8951

  硫酸(試薬)

JIS K 9005

  りん酸(試薬)

JIS K 9007

  りん酸二水素カリウム(試薬)

JIS K 9017

  りん酸水素二カリウム(試薬)

JIS K 9704

  2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール(試薬)

JIS Z 8802

  pH 測定方法


16

K 9809 : 1996

生化学試薬−グルコースほか 1 件工業標準新規原案調査作成委員会  構成表

氏名

所属

(委員長)

奥  山  典  生

神奈川歯科大学

地  崎      修

工業技術院標準部

細  川  幹  夫

通商産業省基礎産業局

国  分  友  邦

通商産業省生命工学工業技術研究所

鈴  木  正  信

通商産業省通商産業検査所

寺  尾  允  男

国立衛生試験所

佐々木      尭

農林水産省食品総合研究所

大  野  忠  夫

特殊法人理化学研究所

赤  木  秀  人

財団法人化学品検査協会

河  崎  忠  好

ファルマシア・バイオテク株式会社

堀  尾  武  一

オリエンタル酵母工業株式会社

竹  内  幸  夫

和光純薬工業株式会社

(事務局)

古  寺  武  利

財団法人バイオインダストリー協会

瀬  下  美和子

財団法人バイオインダストリー協会

生化学試薬−グルコースほか 1 件工業標準新規原案調査作成委員会分科会  構成表

氏名

所属

(分科会長)

竹  内  幸  夫

和光純薬工業株式会社

[主査(グルコース)]

鈴  木  正  信

通商産業省通商産業検査所

[主査(硫酸アンモニウム)]

井  上      肇

ナカライテスク株式会社

[主査(エンドトキシン)]

小  川  義  之

国立衛生試験所大阪支所

斉  藤  幹  彦

株式会社同仁化学研究所

高  野  虞美子

東京化成工業株式会社

松  本  保  輔

財団法人化学品検査協会

友  松  保  幸

関東化学株式会社

児  島      茂

富山薬品工業株式会社

杉  本  純  司

サンエイ糖化株式会社

時  永  大  三

株式会社日立製作所

田  中  重  則

生化学工業株式会社

土  谷  正  和

和光純薬工業株式会社

(事務局)

古  寺  武  利

財団法人バイオインダストリー協会

瀬  下  美和子

財団法人バイオインダストリー協会