日本工業規格
JIS
K
9802
-1993
β
‐NAD
＋
（試薬）
β
-Nicotinamide-adenine dinucleotide, oxidized form
C
21
H
27
N
7
O
14
P
2
FW :
663.44
1.
適用範囲 この規格は，試薬として用いる
β
-NAD
＋
（
β
−ニコチンアミド−アデニン ジヌクレオチド）
（以下，NAD という。
）について規定する。
備考 この規格の引用規格を，次に示す。
JIS K 0068
化学製品の水分測定方法
JIS K 0117
赤外分光分析方法通則
JIS K 0124
高速液体クロマトグラフ分析のための通則
JIS K 8001
試薬試験方法通則
JIS K 8008
生化学試薬通則
JIS K 8101
エタノール (99.5) ［エチルアルコール (99.5) ］
（試薬）
JIS K 8180
塩酸（試薬）
JIS K 8355
酢酸（試薬）
JIS K 8574
水酸化カリウム（試薬）
JIS K 8576
水酸化ナトリウム（試薬）
JIS K 8891
メタノール（試薬）
JIS K 9007
りん酸二水素カリウム（試薬）
JIS K 9704
2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1，3−プロパンジオール［トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン］
（試薬）
2.
共通事項 この規格に共通する事項は，JIS K 8001 及び JIS K 8008 による。
2
K 9802-1993
3.
性質
3.1
性状 NAD は，白色の結晶性の粉末で，においがなく，わずかに酸味がある。
また，NAD は，水に溶けやすく，エタノール，ジエチルエーテルには極めて溶けにくい。
3.2
確認試験 確認試験は，次のとおりとする。
(1) NAD
約 20mg を採り，りん酸緩衝液 (pH7.0, 25℃) 1l に溶かし，分光光度計を用いて極大吸収波長を
測定し，その結果が 259±2nm であること。
(2) NAD
の水溶液（約 1g/l）0.2ml，エタノール−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン水溶液 (pH8.7,
25
℃) (
1
)4ml
及び酵母由来アルコール脱水素酵素液 (50IU/ml) (
2
)0.2ml
を混和して，室温で 15 分間放置
後，分光光度計を用いて極大吸収波長を測定し，その結果が 259±2nm と 339±2nm であること。
注(
1
) 5.1.1(1)
のエタノール−トリス溶液を用いる。
(
2
) 5.1.1(3)
のアルコール脱水素酵素溶液を用いる。
(3)
試料 NAD の赤外吸収スペクトルを JIS K 0117 によって測定するとき，
波数 1 690，
1 420
，
1 230
，
1 080
，
940
及び 815cm
−
1
付近に主な吸収を認める。この場合，試料調製は，JIS K 0117 の 6.2(1)（錠剤法）に
よる。赤外吸収スペクトルの一例を
図 1 に示す。
図 1 赤外吸収スペクトルの一例
4.
品質 品質は，5.によって試験し，表 1 に適合しなければならない。
3
K 9802-1993
表 1 品質
項目
品質
純度（無水塩として） 95%以上
モル吸光係数
ε
260 (18.0
±0.5) ×10
2
l
・mol
−
1
・mm
−
1
ε
340 (
6.3
±0.2) ×10
2
l
・mol
−
1
・mm
−
1
吸光度比
A250/A260 0.83±0.03
A280/A260 0.21±0.02
水分
8%
以下
類似物質
5%
未満
乳酸脱水素酵素インヒビター（相対活性） 98%以上
5.
試験方法
5.1
純度
5.1.1
試薬 試薬は，次のとおりとする。
(1)
エタノール−トリス溶液 JIS K 8101 に規定するエタノール 12ml と，JIS K 97041 に規定するトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン 6.06g (0.05mol) に溶かして 500ml にする。
(2)
りん酸緩衝液 (50mmol/l, pH7.0) JIS K 9007 に規定するりん酸二水素カリウム 1.36g を水 150ml に
溶かし，水酸化カリウム溶液 (2mol/l) (
3
)
を用いて pH7.0 (25℃) に調整後，水で 200ml にする。
注(
3
) JIS K 8574
に規定する水酸化カリウム13g に水を加えて100ml としたもの。
(3)
アルコール脱水素酵素溶液 高純度酵母由来アルコール脱水素酵素（以下，ADH という。）の粉末又
はその溶液を(2)のりん酸緩衝液で，50lU/ml になるように希釈調製(
4
)
する。
注(
4
)
使用時に調製し，氷水中で保存し，0〜4℃に保つ。
(4)
試料溶液 試料 NAD225±10mg をはかりとって水に溶かし，全量フラスコ 100ml に入れ，水を標線ま
で加える。これを試料溶液 a とする。
さらに，試料溶液 a から全量ピペットで正確に 5ml とり，全量フラスコ 25ml に入れ，水を標線ま
で加える。これを試料溶液 b とする。
なお，試料溶液は測定完了まで氷水中で保存し 0〜4℃に保つ。
5.1.2
測定条件 分光光度計の測定条件は，次のとおりとする。
(1)
波長 340±0.3nm
(2)
スペクトルバンド幅 2nm 以下
(3)
光路長 10mm
(4)
測定温度 25℃
5.1.3
測定方法 測定方法は，次のとおりとする。
(1)
試料溶液それぞれについて，
表 2 によって各試料を全量ピペットを用いて各試験管に分注する。
4
K 9802-1993
表 2 反応条件
単位 ml
試験管
A B C D
水
0.2 0.5 0.7 1.0
エタノール−トリス溶液
5.0 5.0 5.0 5.0
試料溶液 b 0.5
0.5
−
−
ADH
溶液 0.3
− 0.3 −
(2)
各試験管を十分かき混ぜて，室温で 15 分間放置する。
(3)
試験管 D を対照として 5.1.2 の測定条件で，試験管 A〜C について，340nm における吸光度を測定す
る。
5.1.4
計算 純度は，次の式によって算出し，その平均値を求める。
∆
A
＝A
340
−(B
340
＋C
340
)
(
)
(
)
W
S
A
G
−
×
×
×
×
×
×
×
×
∆
=
100
100
10
10
3
.
6
5
.
0
100
44
.
663
0
.
6
2
ここに，
A
340
：
試験管
A
の
340nm
における吸光度
B
340
：
試験管
B
の
340nm
における吸光度
C
340
：
試験管
C
の
340nm
における吸光度
G
：
純度
(%)
0.5
：
試料
b
溶液の液量
(ml)
6.3
×
10
2
：
340nm
における
NADH
のモル吸光係数
(l
・
mol
−
1
・
mm
−
1
)
10
：
光路長
(mm)
S
：
試料溶液
b
中の
NAD
濃度
(mg/ml)
6.0
：
試験管内の総液量
(ml)
663.44
：
NAD
の式量
W
：
5.4
で求めた水分
(%)
5.2
モル吸光係数
5.2.1
260nm
におけるモル吸光係数
5.2.1.1
試薬 試薬は，次のとおりとする。
(1)
トリス-塩酸緩衝液 (100mmol/l, pH7.5) トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
6.06g
を水
400ml
に溶解し，塩酸
(6mol/l)
(
5
)
を用いて
pH7.5 (25
℃
)
に調整後，水で
500ml
にする。
注(
5
)
JIS K 8180
に規定する塩酸
54ml
に水を加えて
100ml
としたもの。
(2)
試料溶液 5.1.1(4)の試料溶液
b
による。
5.2.1.2
測定条件 分光光度計の測定条件は，次のとおりとする。
(1)
波長
250
±
0.3nm
(
6
)
，
260
±
0.3nm
及び
280
±
0.3nm
(
6
)
注(
6
)
5.3
において必要となる。
(2)
スペクトルバンド幅
2nm
以下
(3)
光路長
10mm
(4)
測定温度
25
℃
5.2.1.3
測定 測定は，次のとおりとする。
(1)
試料溶液それぞれについて，
表 3 によって各試料を全量ピペットを用いて各試験管に分注する。
5
K 9802-1993
表 3 反応条件
単位
ml
試験管
E F
トリス−塩酸緩衝液 (100mmol/l, pH7.5)
5.0
5.0
試料溶液 b 0.5
−
水
− 0.5
(2)
各試験管を十分かき混ぜる。
(3)
試験管
F
を対照として 5.2.1.2 の測定条件で，試験管
E
の
260nm
における吸光度を測定する。
5.2.1.4
計算 5.2.1.3 の(3)で得られた測定値について，
260nm
におけるモル吸光係数を次の式によって算
出し，その平均値を求める。
(
)
W
S
E
−
×
×
×
×
=
100
100
5
.
0
44
.
663
5
.
5
260
260
ε
ここに，
ε
260
：
260nm
におけるモル吸光係数 (×10
2
l
・mol
−
1
・mm
−
1
)
0.5
：
試料溶液 b の液量 (ml)
S
：
試料溶液 b 中の NAD 濃度 (mg/ml)
E
260
：
試験管 E の 260nm における吸光度
5.5
：
試験管内の総液量 (ml)
663.44
：
NAD
の式量
W
：
5.4
で求めた水分 (%)
5.2.2
340nm
におけるモル吸光係数 5.1 で得られた測定値について，ADH による還元反応後の 340nm
におけるモル吸光係数を次の式によって算出し，その平均値を求める。
(
)
(
)
W
S
C
A
−
×
×
×
×
×
−
=
100
100
10
5
.
0
44
.
663
0
.
6
340
340
340
ε
ここに，
ε
340
：
340nm
におけるモル吸光係数 (×10
2
l
・mol
−
1
・mm
−
1
)
0.5
：
試料溶液 b の液量 (ml)
10
：
光路長 (mm)
S
：
試料溶液 b 中の NAD 濃度 (mg/ml)
A
340
：
試験管 A の 340nm における吸光度
C
340
：
試験管 C の 340nm における吸光度
6.0
：
試験管内の総液量 (ml)
663.44
：
NAD
の式量
W
：
5.4
で求めた水分 (%)
5.3
吸光度比 5.2.1.3 と同様の方法によって，試験管 E の 250nm 及び 280nm における吸光度を測定し，
吸光度比を次の式によって算出する。
A
250
/A
260
＝
260
250
E
E
A
280
/A
260
＝
260
280
E
E
ここに， E
250
：
試験管 E の 250nm における吸光度
E
280
：
試験管 E の 280nm における吸光度
5.4
水分 試料約 30mg を用いて JIS K 0068 の 4.（カールフィッシャー滴定法）で求める。
5.5
類似物質
5.5.1
試薬 試薬は，次のとおりとする。
(1)
試料 NAD 約 10mg をとり，水 10ml に溶かす。
6
K 9802-1993
(2)
酢酸ナトリウム緩衝液 (0.5mol/l, pH5.5) JIS K 8355 に規定する酢酸 30g を水 800ml に入れ，水酸化
ナトリウム溶液 (6mol/l) (
7
)
を用いて pH5.5 (25℃) に調整後，水で 1l にする。
注(
7
)
JIS K 8576
に規定する水酸化ナトリウム25g に水を加えて100ml としたもの。
(3)
酢酸ナトリウム緩衝液 (50mmol/l, pH5.5) (2)の酢酸ナトリウム緩衝液 (0.5mol/l, pH5.5) 100ml を水
で 1l にする。
(4)
メタノール酢酸ナトリウム緩衝液 (50mmol/l, pH5.5) (2)の酢酸ナトリウム緩衝液 (0.5mol/l, pH5.5)
100ml
と JIS K 8891 に規定するメタノール 750ml を混合し，水で 1l にする。
5.5.2
装置 装置は，次のとおりとする。
(1)
装置 高速液体クロマトグラフ。
(1.1)
検出器 波長 260nm で測定可能な紫外吸光検出器。
(1.2)
カラム用管 ステンレス鋼製など。
(1.3)
グラジエント装置
(1.4)
記録計 記録紙送り速度 5mm/min 可能なもの。
(1.5)
データ処理装置
5.5.3
測定方法 測定方法は，次のとおりとする。
(1)
一般事項 JIS K 0124 による。
(2)
分析条件の設定 分析条件は機器によって異なるので，各機器についての最適条件で行わなければな
らない。次に，その一例を示す。
(2.1)
カラム用管 ステンレス鋼製，内径 4.6mm，長さ 250mm。
(2.2)
カラム充てん剤 化学結合型シリカゲル，粒径 5
µm。
参考 TSKGel，ODS120T などがある。
(2.3)
カラム槽温度 室温
(2.4)
溶離液 5.5.1(3)及び(4)を用い，表 4 による。
表 4 溶離液の組成
溶離液（全体で 100%）
時間 (min)
A
ポンプ (%)
B
ポンプ (%)
0
100
0
30 65 35
35 65 35
36
0 100
45
0 100
46
100
0
60
100
0
(2.5)
流速 0.7ml/min
(2.6)
試料導入量 100ul
(2.7)
記録紙送り速度 5mm/min
(3)
クロマトグラムの一例 (2)の分析条件で行ったクロマトグラムの一例を図 2 に示す。
7
K 9802-1993
図 2 クロマトグラムの一例
5.5.4
計算 JIS K 0124 の 8.3.(1)（半値幅法）又は 8.7（データ処理装置を用いる方法）によって，260nm
における各ピークの面積の総和に対する NAD のピーク以外のピークの面積の総和の割合 (%) を求める。
5.6
乳酸脱水素酵素インヒビター
5.6.1
試薬 試薬は，次のとおりとする。
(1)
トリス−塩酸緩衝液 (100mmol/l, pH8.5) トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 12.1g を水 900ml
に溶解し，塩酸 (6mol/l) を用いて pH8.5 (30℃) に調整後，水で 1l にする。使用時には，30℃にする。
(2)
トリス溶液 (150mmol/l) トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 1.82g を水に溶かして，100ml
にする。
(3)
りん酸緩衝液 JIS K 9007 に規定するりん酸二水素カリウム 13.6g を水 800ml に溶解し，水酸化カリ
ウム溶液 (6mol/l) を用いて pH7.0 (30℃) に調整後，高純度牛血清アルブミン 5g を溶かし，水で 1l に
する。
(4)
試料溶液 (80mmol/l) 試料 NAD（無水塩として 265mg）を(2)のトリス溶液 (150mmol/l) 5ml に溶か
す。
(5)
標準 NAD 溶液 (80mmol/l) 高純度 NAD 標準品（無水塩として 48.5mg）を(2)のトリス溶液
(150mmol/l) 5ml
に溶かす。
(6)
乳酸脱水素酵素溶液 うさぎ筋肉由来乳酸脱水素酵素（以下，LDH という。）を酵素たん白質濃度が
15
µg/ml になるように(3)のりん酸緩衝液で溶かすか，又は希釈する。試料溶液は，測定完了まで氷水
中に保存し 0〜4℃に保つ。
(7)
乳酸リチウム溶液 (40mmol/l) L−乳酸リチウム 384mg を(1) トリスー塩酸緩衝液 100ml に溶かす。
使用時には正確に 30℃にする。
5.6.2
装置 温度調節器付きの分光光度計を用いる。
5.6.3
測定条件 分光光度計の測定条件は，次のとおりとする。
(1)
温度 30±1℃
(2)
波長 340±0.3nm
(3)
スペクトルバンド幅 2nm 以下
8
K 9802-1993
(4)
光路長 10mm
5.6.4
測定 測定は，次のとおりとする。
(1)
次の各試薬を吸収セルに入れる。
5.6.1(1)
のトリス−塩酸緩衝液 0.90ml
5.6.1(4)
の試料溶液又は 5.6.1(5)の標準 NAD 溶液
0.30ml
5.6.1(6)
の LDH 溶液 0.02ml
(2)
混和後，吸収セルを分光光度計にセットし，30±1℃，5 分間放置する。
(3)
5.6.1(7)
の乳酸リチウム溶液 1.2ml を吸収セルに入れ，よく混和する。
(4)
反応を 30±1℃で少なくとも 1 分間行う。
(5)
(4)
の結果から，1 分間当たりの吸光度の変化量を求める。
5.6.5
計算 LDH インヒビターは，次の式によって，相対活性として算出する。
100
×
∆
∆
=
c
s
A
A
R
ここに，
R
：
相対活性 (%)
∆A
c
：
標準 NAD 溶液を用いたときの 1 分間当たりの吸光度変化量
∆A
s
：
試料溶液を用いたときの 1 分間当たりの吸光度変化量
6.
容器 遮光できる密栓型容器とする。
7.
貯蔵方法 5℃以下で，暗所に保存(
8
)
する。長期の保存は，−20℃以下で行うことが望ましい。
注(
8
)
吸湿すると，純度が低下する。
8.
表示 表示は，次のとおりとする。
(1)
名称
β
-NAD
＋
及び
試薬
の文字
(2)
英文名称
(3)
化学式
(4)
式量
(5)
品質（実測値）
(6)
内容量
(7)
製造年月又はその略号
(8)
製造番号
(9)
製造業者名又は販売業者名
(10)
保存方法
9
K 9802-1993
JIS K 9802
原案作成委員会 構成表
氏名
所属
（委員長）
奥 山 典 生
東京都立大学理学部
増 田 優
通商産業省基礎産業局
細 川 幹 夫
工業技術院標準部
桑 克 彦
筑波大学医療技術短期大学部
田 中 秀 興
微生物工業技術研究所細胞機能部機能制御研究室
西 末 雄
化学技術研究所化学標準部
鈴 木 正 信
通商産業検査所化学部
大 野 忠 夫
理化学研究所ジーンバンク細胞銀行
栗 原 力
財団法人化学品検査協会東京事業所
坂 田 衛
財団法人日本分析機器工業会
三 木 敬三郎
東燃株式会社総合研究所基礎研究所
角 田 勝
三菱化成株式会社ライフサイエンス室
桜 井 正 二
味の素株式会社アミノ酸部
河 崎 忠 好
ファルマシア株式会社バイオテクノロジーモレキュラー
センター
堀 尾 武 一
オリエンタル酵母工業株式会社長浜生物化学研究所
藤 島 鉄 郎
ヤマサ醤油株式会社研究開発本部特許情報室
竹 内 幸 夫
和光純薬工業株式会社
木 幡 守
協和発酵工業株式会社研究開発本部
第 1 分科会 構成表
氏名
所属
（分科会長）
桜 井 正 二
味の素株式会社アミノ酸部
鈴 木 貞 夫
田辺製薬株式会社分析化学研究所事業部
宗 像 豊 尅
協和発酵工業株式会社生産計画センター
松 岡 学
日本理化学薬品株式会社研究開発本部
北 島 尚
第一化学薬品株式会社化学薬品事業部
第 2 分科会 構成表
氏名
所属
（分科会長）
河 崎 忠 好
ファルマシア株式会社バイオテクノロジーモレキュラー
センター
平 岡 信 次
宝酒造株式会社中央研究所バイオプロダクツセンター
前 川 宜 彦
東洋紡績株式会社生化学事業部
倉 橋 嘉 治
コスモバイオ株式会社営業一部
第 3 分科会 構成表
氏名
所属
（分科会長）
桑 克 彦
筑波大学医療技術短期大学部
藤 田 剛
オリエンタル酵母工業株式会社生化学開発センター製
品開発室
宗 像 豊 尅
協和発酵工業株式会社生産計画センター
友 松 保 幸
関東化学株式会社試薬事業本部学術部
10
K 9802-1993
第 4 分科会 構成表
氏名
所属
（分科会長）
藤 島 鉄 郎
ヤマサ醤油株式会社研究開発本部特許情報室
宗 像 豊 尅
協和発酵工業株式会社生産計画センター
斉 藤 幹 彦
株式会社同仁化学研究所技術部
第 5 分科会 構成表
氏名
所属
（分科会長）
竹 内 幸 夫
和光純薬工業株式会社
井 上 肇
ナカライテクス株式会社
斉 藤 幹 彦
株式会社同仁化学研究所技術部
高 野 虞美子
東京化成工業株式会社検査部
飯 島 弘 淳
財団法人化学品検査協会化学標準部