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日本工業規格

JIS

 K

9802

-1993

β

‐NAD

(試薬)

β

-Nicotinamide-adenine dinucleotide, oxidized form

C

21

H

27

N

7

O

14

P

2

  FW :

663.44

1.

適用範囲  この規格は,試薬として用いる

β

-NAD

β

−ニコチンアミド−アデニン  ジヌクレオチド)

(以下,NAD という。

)について規定する。

備考  この規格の引用規格を,次に示す。

JIS K 0068

  化学製品の水分測定方法

JIS K 0117

  赤外分光分析方法通則

JIS K 0124

  高速液体クロマトグラフ分析のための通則

JIS K 8001

  試薬試験方法通則

JIS K 8008

  生化学試薬通則

JIS K 8101

  エタノール (99.5) [エチルアルコール (99.5) ]

(試薬)

JIS K 8180

  塩酸(試薬)

JIS K 8355

  酢酸(試薬)

JIS K 8574

  水酸化カリウム(試薬)

JIS K 8576

  水酸化ナトリウム(試薬)

JIS K 8891

  メタノール(試薬)

JIS K 9007

  りん酸二水素カリウム(試薬)

JIS K 9704

  2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール[トリス(ヒドロキシメチ

ル)アミノメタン]

(試薬)

2.

共通事項  この規格に共通する事項は,JIS K 8001 及び JIS K 8008 による。


2

K 9802-1993

3.

性質

3.1

性状  NAD は,白色の結晶性の粉末で,においがなく,わずかに酸味がある。

また,NAD は,水に溶けやすく,エタノール,ジエチルエーテルには極めて溶けにくい。

3.2

確認試験  確認試験は,次のとおりとする。

(1) NAD

約 20mg を採り,りん酸緩衝液 (pH7.0, 25℃) 1に溶かし,分光光度計を用いて極大吸収波長を

測定し,その結果が 259±2nm であること。

(2) NAD

の水溶液(約 1g/l)0.2ml,エタノール−トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン水溶液 (pH8.7,

25

℃) (

1

)4ml

及び酵母由来アルコール脱水素酵素液 (50IU/ml) (

2

)0.2ml

を混和して,室温で 15 分間放置

後,分光光度計を用いて極大吸収波長を測定し,その結果が 259±2nm と 339±2nm であること。

(

1

)  5.1.1(1)

のエタノール−トリス溶液を用いる。

(

2

)  5.1.1(3)

のアルコール脱水素酵素溶液を用いる。

(3)

試料 NAD の赤外吸収スペクトルを JIS K 0117 によって測定するとき,

波数 1 690,

1 420

1 230

1 080

940

及び 815cm

1

付近に主な吸収を認める。この場合,試料調製は,JIS K 0117 の 6.2(1)(錠剤法)に

よる。赤外吸収スペクトルの一例を

図 に示す。

図 1  赤外吸収スペクトルの一例

4.

品質  品質は,5.によって試験し,表 に適合しなければならない。


3

K 9802-1993

表 1  品質

項目

品質

純度(無水塩として) 95%以上

モル吸光係数

ε

260 (18.0

±0.5)  ×10

2

l

・mol

1

・mm

1

ε

340 (

6.3

±0.2)  ×10

2

l

・mol

1

・mm

1

吸光度比

  A250/A260 0.83±0.03

  A280/A260 0.21±0.02 
水分

8%

以下

類似物質

5%

未満

乳酸脱水素酵素インヒビター(相対活性) 98%以上

5.

試験方法

5.1

純度

5.1.1

試薬  試薬は,次のとおりとする。

(1)

エタノール−トリス溶液  JIS K 8101 に規定するエタノール 12ml と,JIS K 97041 に規定するトリス

(ヒドロキシメチル)アミノメタン 6.06g (0.05mol)  に溶かして 500ml にする。

(2)

りん酸緩衝液 (50mmol/l, pH7.0)    JIS K 9007 に規定するりん酸二水素カリウム 1.36g を水 150ml に

溶かし,水酸化カリウム溶液 (2mol/l(

3

)

を用いて pH7.0 (25℃)  に調整後,水で 200ml にする。

(

3

)  JIS K 8574

に規定する水酸化カリウム13g に水を加えて100ml としたもの。

(3)

アルコール脱水素酵素溶液  高純度酵母由来アルコール脱水素酵素(以下,ADH という。)の粉末又

はその溶液を(2)のりん酸緩衝液で,50lU/ml になるように希釈調製(

4

)

する。

(

4

)

使用時に調製し,氷水中で保存し,0∼4℃に保つ。

(4)

試料溶液  試料 NAD225±10mg をはかりとって水に溶かし,全量フラスコ 100ml に入れ,水を標線ま

で加える。これを試料溶液 a とする。

さらに,試料溶液 a から全量ピペットで正確に 5ml とり,全量フラスコ 25ml に入れ,水を標線ま

で加える。これを試料溶液 b とする。

なお,試料溶液は測定完了まで氷水中で保存し 0∼4℃に保つ。

5.1.2

測定条件  分光光度計の測定条件は,次のとおりとする。

(1)

波長  340±0.3nm

(2)

スペクトルバンド幅  2nm 以下

(3)

光路長  10mm

(4)

測定温度  25℃

5.1.3

測定方法  測定方法は,次のとおりとする。

(1)

試料溶液それぞれについて,

表 によって各試料を全量ピペットを用いて各試験管に分注する。


4

K 9802-1993

表 2  反応条件

単位 ml

試験管

A B C D

0.2 0.5 0.7 1.0

エタノール−トリス溶液

5.0 5.0 5.0 5.0

試料溶液 b 0.5

0.5

ADH

溶液 0.3

− 0.3 −

(2)

各試験管を十分かき混ぜて,室温で 15 分間放置する。

(3)

試験管 D を対照として 5.1.2 の測定条件で,試験管 A∼C について,340nm における吸光度を測定す

る。

5.1.4

計算  純度は,次の式によって算出し,その平均値を求める。

A

A

340

−(B

340

C

340

)

(

)

(

)

W

S

A

G

×

×

×

×

×

×

×

×

=

100

100

10

10

3

.

6

5

.

0

100

44

.

663

0

.

6

2

ここに,

A

340

試験管

A

340nm

における吸光度

B

340

試験管

B

340nm

における吸光度

C

340

試験管

C

340nm

における吸光度

G

純度

 (%)

0.5

試料

b

溶液の液量

 (ml)

6.3

×

10

2

340nm

における

NADH

のモル吸光係数

  (l

mol

1

mm

1

)

10

光路長

 (mm)

S

試料溶液

b

中の

NAD

濃度

 (mg/ml)

6.0

試験管内の総液量

 (ml)

663.44

NAD

の式量

W

5.4

で求めた水分

 (%)

5.2

モル吸光係数

5.2.1

260nm

におけるモル吸光係数

5.2.1.1

試薬  試薬は,次のとおりとする。

(1)

トリス-塩酸緩衝液 (100mmol/l, pH7.5)    トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン

6.06g

を水

400ml

に溶解し,塩酸

 (6mol/l)

(

5

)

を用いて

pH7.5 (25

)

に調整後,水で

500ml

にする。

(

5

)

JIS K 8180

に規定する塩酸

54ml

に水を加えて

100ml

としたもの。

(2)

試料溶液  5.1.1(4)の試料溶液

b

による。

5.2.1.2

測定条件  分光光度計の測定条件は,次のとおりとする。

(1)

波長

250

±

0.3nm

(

6

)

260

±

0.3nm

及び

280

±

0.3nm

(

6

)

(

6

)

5.3

において必要となる。

(2)

スペクトルバンド幅

2nm

以下

(3)

光路長

10mm

(4)

測定温度

25

5.2.1.3

測定  測定は,次のとおりとする。

(1)

試料溶液それぞれについて,

表 によって各試料を全量ピペットを用いて各試験管に分注する。


5

K 9802-1993

表 3  反応条件

単位

ml

試験管

E F

トリス−塩酸緩衝液 (100mmol/l, pH7.5)

5.0

5.0

試料溶液 b 0.5

− 0.5

(2)

各試験管を十分かき混ぜる。

(3)

試験管

F

を対照として 5.2.1.2 の測定条件で,試験管

E

260nm

における吸光度を測定する。

5.2.1.4

計算  5.2.1.3 (3)で得られた測定値について,

260nm

におけるモル吸光係数を次の式によって算

出し,その平均値を求める。

(

)

W

S

E

×

×

×

×

=

100

100

5

.

0

44

.

663

5

.

5

260

260

ε

ここに,

ε

260

260nm

におけるモル吸光係数  (×10

2

l

・mol

1

・mm

1

)

0.5

試料溶液 b の液量 (ml)

S

試料溶液 b 中の NAD 濃度 (mg/ml)

E

260

試験管 E の 260nm における吸光度

5.5

試験管内の総液量 (ml)

663.44

NAD

の式量

W

5.4

で求めた水分 (%)

5.2.2

340nm

におけるモル吸光係数  5.1 で得られた測定値について,ADH による還元反応後の 340nm

におけるモル吸光係数を次の式によって算出し,その平均値を求める。

(

)

(

)

W

S

C

A

×

×

×

×

×

=

100

100

10

5

.

0

44

.

663

0

.

6

340

340

340

ε

ここに,

ε

340

340nm

におけるモル吸光係数  (×10

2

l

・mol

1

・mm

1

)

0.5

試料溶液 b の液量 (ml)

10

光路長 (mm)

S

試料溶液 b 中の NAD 濃度 (mg/ml)

A

340

試験管 A の 340nm における吸光度

C

340

試験管 C の 340nm における吸光度

6.0

試験管内の総液量 (ml)

663.44

NAD

の式量

W

5.4

で求めた水分 (%)

5.3

吸光度比  5.2.1.3 と同様の方法によって,試験管 E の 250nm 及び 280nm における吸光度を測定し,

吸光度比を次の式によって算出する。

A

250

/A

260

260

250

E

E

A

280

/A

260

260

280

E

E

ここに,  E

250

試験管 E の 250nm における吸光度

E

280

試験管 E の 280nm における吸光度

5.4

水分  試料約 30mg を用いて JIS K 0068 の 4.(カールフィッシャー滴定法)で求める。

5.5

類似物質

5.5.1

試薬  試薬は,次のとおりとする。

(1)

試料  NAD 約 10mg をとり,水 10ml に溶かす。


6

K 9802-1993

(2)

酢酸ナトリウム緩衝液 (0.5mol/l, pH5.5)    JIS K 8355 に規定する酢酸 30g を水 800ml に入れ,水酸化

ナトリウム溶液 (6mol/l(

7

)

を用いて pH5.5 (25℃)  に調整後,水で 1にする。

(

7

)

  JIS K 8576

に規定する水酸化ナトリウム25g に水を加えて100ml としたもの。

(3)

酢酸ナトリウム緩衝液 (50mmol/l, pH5.5)   (2)の酢酸ナトリウム緩衝液 (0.5mol/l, pH5.5) 100ml を水

で 1にする。

(4)

メタノール酢酸ナトリウム緩衝液 (50mmol/l, pH5.5)    (2)の酢酸ナトリウム緩衝液 (0.5mol/l, pH5.5)

100ml

と JIS K 8891 に規定するメタノール 750ml を混合し,水で 1にする。

5.5.2

装置  装置は,次のとおりとする。

(1)

装置  高速液体クロマトグラフ。

(1.1)

検出器  波長 260nm で測定可能な紫外吸光検出器。

(1.2)

カラム用管  ステンレス鋼製など。

(1.3)

グラジエント装置

(1.4)

記録計  記録紙送り速度 5mm/min 可能なもの。

(1.5)

データ処理装置

5.5.3

測定方法  測定方法は,次のとおりとする。

(1)

一般事項  JIS K 0124 による。

(2)

分析条件の設定  分析条件は機器によって異なるので,各機器についての最適条件で行わなければな

らない。次に,その一例を示す。

(2.1)

カラム用管  ステンレス鋼製,内径 4.6mm,長さ 250mm。

(2.2)

カラム充てん剤  化学結合型シリカゲル,粒径 5

µm。

参考 TSKGel,ODS120T などがある。

(2.3)

カラム槽温度  室温

(2.4)

溶離液  5.5.1(3)及び(4)を用い,表 による。

表 4  溶離液の組成

溶離液(全体で 100%)

時間 (min)

A

ポンプ (%)

B

ポンプ (%)

 0

100

  0

30 65  35

35 65  35

36

0 100

45

0 100

46

100

  0

60

100

  0

(2.5)

流速  0.7ml/min

(2.6)

試料導入量  100ul

(2.7)

記録紙送り速度  5mm/min

(3)

クロマトグラムの一例  (2)の分析条件で行ったクロマトグラムの一例を図 に示す。


7

K 9802-1993

図 2  クロマトグラムの一例

5.5.4

計算  JIS K 0124 の 8.3.(1)(半値幅法)又は 8.7(データ処理装置を用いる方法)によって,260nm

における各ピークの面積の総和に対する NAD のピーク以外のピークの面積の総和の割合 (%) を求める。

5.6

乳酸脱水素酵素インヒビター

5.6.1

試薬  試薬は,次のとおりとする。

(1)

トリス−塩酸緩衝液 (100mmol/l, pH8.5)    トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 12.1g を水 900ml

に溶解し,塩酸 (6mol/l)  を用いて pH8.5 (30℃)  に調整後,水で 1にする。使用時には,30℃にする。

(2)

トリス溶液 (150mmol/l)    トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン 1.82g を水に溶かして,100ml

にする。

(3)

りん酸緩衝液  JIS K 9007 に規定するりん酸二水素カリウム 13.6g を水 800ml に溶解し,水酸化カリ

ウム溶液 (6mol/l)  を用いて pH7.0 (30℃)  に調整後,高純度牛血清アルブミン 5g を溶かし,水で 1

する。

(4)

試料溶液 (80mmol/l)    試料 NAD(無水塩として 265mg)を(2)のトリス溶液 (150mmol/l) 5ml に溶か

す。

(5)

標準 NAD 溶液 (80mmol/l)    高純度 NAD 標準品(無水塩として 48.5mg)を(2)のトリス溶液

(150mmol/l) 5ml

に溶かす。

(6)

乳酸脱水素酵素溶液  うさぎ筋肉由来乳酸脱水素酵素(以下,LDH という。)を酵素たん白質濃度が

15

µg/ml になるように(3)のりん酸緩衝液で溶かすか,又は希釈する。試料溶液は,測定完了まで氷水

中に保存し 0∼4℃に保つ。

(7)

乳酸リチウム溶液 (40mmol/l)    L−乳酸リチウム 384mg を(1)  トリスー塩酸緩衝液 100ml に溶かす。

使用時には正確に 30℃にする。

5.6.2

装置  温度調節器付きの分光光度計を用いる。

5.6.3

測定条件  分光光度計の測定条件は,次のとおりとする。

(1)

温度  30±1℃

(2)

波長  340±0.3nm

(3)

スペクトルバンド幅  2nm 以下


8

K 9802-1993

(4)

光路長  10mm

5.6.4

測定  測定は,次のとおりとする。

(1)

次の各試薬を吸収セルに入れる。

5.6.1(1)

のトリス−塩酸緩衝液 0.90ml

5.6.1(4)

の試料溶液又は 5.6.1(5)の標準 NAD 溶液

0.30ml

5.6.1(6)

の LDH 溶液 0.02ml

(2)

混和後,吸収セルを分光光度計にセットし,30±1℃,5 分間放置する。

(3)

  5.6.1(7)

の乳酸リチウム溶液 1.2ml を吸収セルに入れ,よく混和する。

(4)

反応を 30±1℃で少なくとも 1 分間行う。

(5)

  (4)

の結果から,1 分間当たりの吸光度の変化量を求める。

5.6.5

計算  LDH インヒビターは,次の式によって,相対活性として算出する。

100

×

=

c

s

A

A

R

ここに,

R

相対活性 (%)

A

c

標準 NAD 溶液を用いたときの 1 分間当たりの吸光度変化量

A

s

試料溶液を用いたときの 1 分間当たりの吸光度変化量

6.

容器  遮光できる密栓型容器とする。

7.

貯蔵方法  5℃以下で,暗所に保存(

8

)

する。長期の保存は,−20℃以下で行うことが望ましい。

(

8

)

吸湿すると,純度が低下する。

8.

表示  表示は,次のとおりとする。

(1)

名称  “

β

-NAD

”及び“試薬”の文字

(2)

英文名称

(3)

化学式

(4)

式量

(5)

品質(実測値)

(6)

内容量

(7)

製造年月又はその略号

(8)

製造番号

(9)

製造業者名又は販売業者名

(10)

保存方法


9

K 9802-1993

JIS K 9802

  原案作成委員会  構成表

氏名

所属

(委員長)

奥  山  典  生

東京都立大学理学部

増  田      優

通商産業省基礎産業局

細  川  幹  夫

工業技術院標準部

桑      克  彦

筑波大学医療技術短期大学部

田  中  秀  興

微生物工業技術研究所細胞機能部機能制御研究室

西      末  雄

化学技術研究所化学標準部

鈴  木  正  信

通商産業検査所化学部

大  野  忠  夫

理化学研究所ジーンバンク細胞銀行

栗  原      力

財団法人化学品検査協会東京事業所

坂  田      衛

財団法人日本分析機器工業会

三  木  敬三郎

東燃株式会社総合研究所基礎研究所

角  田      勝

三菱化成株式会社ライフサイエンス室

桜  井  正  二

味の素株式会社アミノ酸部

河  崎  忠  好

ファルマシア株式会社バイオテクノロジーモレキュラー

センター

堀  尾  武  一

オリエンタル酵母工業株式会社長浜生物化学研究所

藤  島  鉄  郎

ヤマサ醤油株式会社研究開発本部特許情報室

竹  内  幸  夫

和光純薬工業株式会社

木  幡      守

協和発酵工業株式会社研究開発本部

第 1 分科会  構成表

氏名

所属

(分科会長)

桜  井  正  二

味の素株式会社アミノ酸部

鈴  木  貞  夫

田辺製薬株式会社分析化学研究所事業部

宗  像  豊  尅

協和発酵工業株式会社生産計画センター

松  岡      学

日本理化学薬品株式会社研究開発本部

北  島      尚

第一化学薬品株式会社化学薬品事業部

第 2 分科会  構成表

氏名

所属

(分科会長)

河  崎  忠  好

ファルマシア株式会社バイオテクノロジーモレキュラー

センター

平  岡  信  次

宝酒造株式会社中央研究所バイオプロダクツセンター

前  川  宜  彦

東洋紡績株式会社生化学事業部

倉  橋  嘉  治

コスモバイオ株式会社営業一部

第 3 分科会  構成表

氏名

所属

(分科会長)

桑      克  彦

筑波大学医療技術短期大学部

藤  田      剛

オリエンタル酵母工業株式会社生化学開発センター製

品開発室

宗  像  豊  尅

協和発酵工業株式会社生産計画センター

友  松  保  幸

関東化学株式会社試薬事業本部学術部


10

K 9802-1993

第 4 分科会  構成表

氏名

所属

(分科会長)

藤  島  鉄  郎

ヤマサ醤油株式会社研究開発本部特許情報室

宗  像  豊  尅

協和発酵工業株式会社生産計画センター

斉  藤  幹  彦

株式会社同仁化学研究所技術部

第 5 分科会  構成表

氏名

所属

(分科会長)

竹  内  幸  夫

和光純薬工業株式会社

井  上      肇

ナカライテクス株式会社

斉  藤  幹  彦

株式会社同仁化学研究所技術部

高  野  虞美子

東京化成工業株式会社検査部

飯  島  弘  淳

財団法人化学品検査協会化学標準部