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K 3810-1

:2003

(1)

まえがき

この規格は,工業標準化法第 14 条によって準用する第 12 条第 1 項の規定に基づき,財団法人バイオイ

ンダストリー協会 (JBA)/財団法人日本規格協会 (JSA) から,工業標準原案を具して日本工業規格を改正

すべきとの申出があり,日本工業標準調査会の審議を経て,

経済産業大臣が改正した日本工業規格である。

これによって,JIS K 3810-1 : 1997 は改正され,この規格に置き換えられる。

JIS K 3810

の規格群には,次に示す部編成がある。

JIS K 3810-1

  第 1 部:培養による直接検出法

JIS K 3810-2

  第 2 部:DNA 蛍光染色による間接検出法

JIS K 3810-3

  第 3 部:二段階PCRによる検出法


K 3810-1

:2003

(2)

目  次

ページ

1.

  適用範囲

1

2.

  引用規格

1

3.

  定義

1

4.

  陽性対照マイコプラズマ

1

5.

  試験方法

1

5.1

  試薬

1

5.2

  装置及び器具

2

5.3

  完全培地の調製

2

5.4

  検体試料の調製法

3

5.5

  マイコプラズマの接種及び培養方法

3

5.6

  マイコプラズマの判定

3

 


日本工業規格

JIS

 K

3810-1

:2003

マイコプラズマの検出法−

第 1 部:培養による直接検出法

Mycoplasma detection methods

Part 1: Microbiological cultivation assay

1.

適用範囲  この規格は,細胞培養及び細胞培養に用いられる試薬類並びに細胞培養によって生産され

た製品からマイコプラズマを分離培養して検出する方法について規定する。

2.

引用規格  次に掲げる規格は,この規格に引用されることによって,この規格の規定の一部を構成す

る。これらの引用規格は,その最新版(追補を含む。

)を適用する。

JIS K 0950

  プラスチック製滅菌シャーレ

JIS K 3600

  バイオテクノロジー用語

JIS K 3604

  組織培養用培地(最小必須培地)

JIS K 3605

  高圧蒸気滅菌操作通則

JIS Z 8802

  pH 測定方法

3.

定義  この規格で用いる主な用語の定義は,JIS K 3600 によるほか,次による。

a)

蒸留水  JIS K 3604 に規定する純水。

b)

マイコプラズマ  無細胞培地で発育可能な無細胞壁原核生物。DNA をゲノムとしてもつ。

c)

コロニー形成単位 [Colony Forming Unit (CFU)  ]  寒天培地上で 1 個のコロニーを形成する試料 1 ml

中のマイコプラズマの量。

d)  PPLO

寒天粉末  マイコプラズマの古い呼称である Pleuropneumonia-like Organism に由来する PPLO を

培養するための基礎培地成分。寒天を含まないものは PPLO 粉末と呼ばれ,ウシ心臓抽出物,ペプト

ン,塩化ナトリウムなどを含む。

4.

陽性対照マイコプラズマ  陽性対照として用いる,Mycoplasma hyorhinis(ATCC 29052 又は IFO 14858)

及び Mycoplasma arginini(ATCC 23838 又は IFO 14476)

5.

試験方法

5.1

試薬

5.1.1

イースト・エキストラクト  (25 %)  マイコプラズマ培養のためには自家調製したものが最も優れ

ている。これとほぼ同等の性能をもつ市販イースト抽出液を用いてもよい。粉末のイースト抽出物を用い

たものは培養性能が多少劣るので,初代分離培養のときの陰性結果の判定を複雑にする場合がある。


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K 3810-1

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イースト・エキストラクト (25 %) の自家調整は,次の方法による。

a)

蒸留水 1 L に製パン用ドライイースト 250 g を溶かす。

b)

沸騰水中で 30 分間浸出し,水冷する。

c)

冷却後,14 000×g(実効回転半径 12 cm の遠心機で 10 000 rpm)

,30 分間遠心し,上澄み液を採取す

る。

d)

水酸化ナトリウム溶液 (0.5 mol/L) で JIS Z 8802 に規定する pH 計を用いて pH7.8 に調節する。

e)

孔径 0.2

µm 又は 0.45 µm フィルタを取り付けたろ過器で除菌する。

f)

ろ過液は使用時まで−20  ℃以下で保存する。

5.1.2

酢酸タリウム溶液  (2.5 %)  純度 95 %以上の酢酸タリウム 25 g を蒸留水 1 L に溶かし,JIS K 3605

に規定する高圧蒸気滅菌装置を用いて 120  ℃,15 分間滅菌後,室温に保存する。

  警告  酢酸タリウムは潮解性無色結晶の劇物のため取り扱いには注意をようする。

5.1.3

ペニシリン  ペニシリン G カリウムを蒸留水で 10 万単位/ml に調製し,孔径 0.2

µm 又は 0.45  µm

のメンブランフィルタを用いてろ過除菌後,凍結保存する。

  警告  ペニシリンは安易に耐性菌を生み出さないよう使い方には注意をようする。

5.1.4

ウマ血清  市販の非加熱ウマ血清を用いる。

5.2

装置及び器具

5.2.1

培地容器  寒天培地では,JIS K 0950 に規定する直径 4.5 cm のプラスチック製滅菌シャーレを用

いる。二層培地では,直径 8×100 mm の滅菌したプラスチック製密栓付試験管を用いる。

a)

インキュベータ  温度 37±0.5  ℃に調節できるもの。

b)

ろ過滅菌器  孔径 0.45

µm でろ過し,更に孔径 0.2 µm のメンブランフィルタでろ過できる構造をもつ

もの。

c)

高圧蒸気滅菌器  JIS K 3605 に規定するもの。

d)

倒立顕微鏡  10∼100 倍に拡大できるもの。

e)

クリーンベンチ  JIS K 3604 に規定するもの。

5.3

完全培地の調製

5.3.1

完全マイコプラズマ寒天培地  培地組成を表 に示す。

  1  完全マイコプラズマ寒天培地

成分

添加量

(A) PPLO

寒天粉末  (

1

)

蒸留水

2.4 g

70 ml

(B)

ウマ血清(非加熱)

 25

%

イースト・エキストラクト

酢酸タリウム溶液 (25 g/L)

 10

万単位/ml ペニシリン G カリウム

20 ml

10 ml

 1 ml

 1 ml

(

1

) PPLO

寒天粉末に蒸留水を加え,121  ℃で 15 分間煮沸し,寒天を溶かす。

55

℃に冷却後,(B)  を無菌的に加える。

PPLO

寒天培地は乾燥を防ぐため,ポリ塩化ビニル袋,缶などに入れて冷蔵庫に

保存する。

5.3.2

完全マイコプラズマ液体培地  培地組成を表 に示す。

なお,蒸留水は,121  ℃で 15 分間滅菌後,放冷してから

表 の組成を無菌的に加える。


3

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  2  完全マイコプラズマ液体培地

成分

添加量

PPLO

粉末  (

2

)

(クリスタルバイオレットを含まない。

蒸留水 
ウマ血清(非加熱)

25 %

イースト・エキストラクト

酢酸タリウム溶液 (25 g/L)

10

万単位/ml ペニシリン G カリウム

L-

アルギニン塩酸塩 (100 g/L)

D (

+)-グルコース (100 g/L)

フェノールレッド (10 g/L)

2.1 g

61 ml

20 ml

10 ml

 1 ml

 1 ml

  2 ml (

2

) (0.2 %)

  5 ml (

2

) (0.5 %)

  0.2 ml (

2

) (0.002 %)

(

2

) PPLO

粉末に蒸留水 61 ml を加え,121  ℃で 15 分間高圧滅菌する。室温に冷却後,

残りの成分を無菌的に加え,全量を 100 ml にする。

5.3.3

二層培地  二層培地を図 に示す。

a)

小試験管に完全マイコプラズマ寒天培地 1 ml を入れて固める。

b)

完全マイコプラズマ液体培地 2 ml を重層する。

  1  二層培地

5.4

検体試料の調製法  検体が液体又はサスペンジョンの場合はそのまま,若しくはマイコプラズマ液

体培地によって 2 倍段階希釈を行い,それぞれの希釈段階のものを接種材料とする。また,検体が固体の

場合は,マイコプラズマ液体培地とともにホモゲナイズしてから,サスペンジョンと同じ取扱いをする。

5.5

マイコプラズマの接種及び培養方法  マイコプラズマの培養は,寒天培地及び二層培地に同時に接

種する。

a)

寒天培地  直径 4.5 cm のプラスチック製滅菌シャーレに対し,ピペットを用いて検体 0.1 ml を接種す

る。密閉できるプラスチック製又は金属製の箱に入れ,蒸留水を含ませた脱脂綿を小容器に入れ接種

培地とともに箱内に入れて湿度を保った状態で,37±1  ℃で 3∼20 日間培養する。

b)

二層培地  二層培地に検体 0.1 ml を接種し,37±1  ℃で培養する。接種後 7 日目及び 14 日目に液層

から 0.1 ml をとって寒天培地に接種する。寒天培地を用いた培養法と同様に 14 日間培養する。


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5.6

マイコプラズマの判定  マイコプラズマの判定は,次による。

a)

寒天培地  接種の 3∼20 日後に 20∼40 倍の倒立顕微鏡下でコロニーの有無を観察する。マイコプラズ

マのコロニーは,コロニーの中心にニプルを形成し,全体として直径 0.1∼0.5 mm,目玉焼き状の形

態を示す。

b)

二層培地  接種の 14 日後に,培地の混濁の有無,マイクロコロニーの出現の有無及び培地の pH の変

化による色調の変化を観察する。

c)

二層培地の液層  0.1 ml を接種した寒天培地は,接種した 14 日後にコロニーを確認する。