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K 3703-3:2008

(1)

まえがき

この規格は,工業標準化法第 12 条第 1 項の規定に基づき,財団法人バイオインダストリー協会(JBA)及

び財団法人日本規格協会(JSA)から,工業標準原案を具して日本工業規格を制定すべきとの申出があり,日

本工業標準調査会の審議を経て,経済産業大臣が制定した日本工業規格である。

この規格は,著作権法で保護対象となっている著作物である。

この規格の一部が,特許権,出願公開後の特許出願,実用新案権又は出願公開後の実用新案登録出願に

抵触する可能性があることに注意を喚起する。経済産業大臣及び日本工業標準調査会は,このような特許

権,出願公開後の特許出願,実用新案権又は出願公開後の実用新案登録出願に係る確認について,責任は

もたない。

JIS K 3703 の規格群には,次に示す部編成がある。

JIS K 3703-1  第 1 部:ベアード・パーカー寒天培地

JIS K 3703-2  第 2 部:ウサギ血しょう(漿)フィブリノーゲン寒天培地

JIS K 3703-3  第 3 部:低菌数の検出法及び最確数(MPN)法による生菌数測定法


 
K 3703-3:2008

(2)

目  次

ページ

序文

1

1.  適用範囲

1

2.  引用規格

1

3.  定義

2

4.  一般原則

2

4.1  検出法

2

4.2  生菌数測定法

3

5.  希釈液及び培地

3

5.1  希釈液

3

5.2  改変 Giolitti-Cantoni ブロス(ブイヨン又は液体培地)

3

5.3  寒天溶液

5

5.4  ベアード・パーカー選択寒天培地

5

5.5  ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地

6

5.6  ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス(ブイヨン又は液体培地)

6

5.7  ウサギ血しょう

7

6.  装置及び器具

7

6.1  細菌培養器

7

6.2  乾燥キャビネット又は乾燥器

7

6.3  シャーレ

7

6.4  白金線

7

6.5  白金耳

7

6.6  試験管

7

6.7  目盛付きピペット(メスピペット)

7

6.8  ウォーターバス

7

6.9  薬さじ

7

6.10  嫌気ジャー

7

7.  サンプリング方法

7

8.  試料の調製

7

9.  手順

7

9.1  検出法

8

9.2  生菌数測定法

8

9.3  平板の選択及び判定

8

10.  試験結果の表現

10

10.1  検出法

10

10.2  生菌数測定法

10


K 3703-3:2008  目次

(3)

ページ

11.  精度

10

12.  試験報告書

10

参考文献

11

附属書(参考)JIS と対応する国際規格との対比表

12

 
 
 


 
K 3703-3:2008

(4)

白      紙


日本工業規格

JIS

 K

3703-3

:2008

コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌など)

の菌数測定方法−第 3 部:低菌数の検出法及び

最確数(MPN)法による生菌数測定法

Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci

(Staphylococcus aureus and other species) Part 3: Detection and MPN

technique for low numbers

序文  この規格は,2003 年に第 1 版として発行された ISO 6888-3,Microbiology of food and animal feeding

stuffs−Horizontal method for the enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and

other species)−Part 3: Detection and MPN technique for low numbers を翻訳し,技術的内容を変更して作成し

た日本工業規格である。

なお,この規格で点線の下線を施してある箇所は,原国際規格を変更している事項である。変更の一覧

表をその説明を付けて,

附属書(参考)に示す。

1.  適用範囲  この規格は,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌用培地を用いて低菌数のコアグラーゼ陽性ブド

ウ球菌(黄色ブドウ球菌及びその他の種)を検出する方法について規定する。この規格で用いる試料は,

食品,動物用飼料及び食品を製造若しくは取り扱う現場の環境試料とする。

備考1.  この規格は,当該ブドウ球菌がストレスを受けて,その数が少ないと予想される乾燥試料な

どに利用できる。コアグラーゼ陽性ブドウ球菌は,主に黄色ブドウ球菌(Staphylococcus 

aureus)であるが,Staphylococcus intermediusStaphylococcus hyicusStaphylococcus delphini

Staphylococcus schleiferi などの一部の菌株もコアグラーゼを産生する。

2.  この規格の対応国際規格を,次に示す。

なお,対応の程度を表す記号は,ISO/IEC Guide 21 に基づき,IDT(一致している)

,MOD

(修正している)

,NEQ(同等でない)とする。

ISO 6888-3:2003,Microbiology of food and animal feeding stuffs−Horizontal method for the

enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)−

Part 3: Detection and MPN technique for low numbers (MOD)

2.  引用規格  次に掲げる規格は,この規格に引用されることによって,この規格の規定の一部を構成す

る。これらの引用規格は,その最新版(追補を含む。

)を適用する。

JIS K 3701  培地の試験方法−通則

備考  ISO 7218:1996,Microbiology of food and animal feeding stuffs−General rules for microbiological

examinations 及び AMENDMENT 1:2001 からの引用事項は,この規格の該当事項と同等であ



K 3703-3:2008

る。

JIS K 3702  培地の試験方法−試料懸濁液及び希釈系列の調製方法

備考  ISO 6887-1:1999,Microbiology of food and animal feeding stuffs−Preparation of test samples,

initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination−Part 1: General rules for

the preparation of the initial suspension and decimal dilutions からの引用事項は,この規格の該当

事項と同等である。

JIS K 3703-1  コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌など)の菌数測定方法−第 1 部:ベア

ード・パーカー寒天培地

備考  ISO 6888-1:1999,Microbiology of food and animal feeding stuffs−Horizontal method for the

enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)  −Part 1:

Technique using Baird-Parker agar medium からの引用事項は,この規格の該当事項と同等であ

る。

JIS K 3703-2  コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌など)の菌数測定方法−第 2 部:ウサ

ギ血しょう(漿)フィブリノーゲン寒天培地

備考  ISO 6888-2:1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs−Horizontal method for the

enumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species)−Part 2:

Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium からの引用事項は,この規格の該当事項と

同等である。

JIS K 8008  生化学試薬通則

ISO/TS 11133-2:2003  Microbiology of food and animal feeding stuffs−Guidelines on preparation and

production of culture media−Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media

3.  定義  この規格で用いる主な用語の定義は,JIS K 3701JIS K 3702JIS K 3703-1JIS K 3703-2
JIS K 8008 によるほか,次による。

3.1

コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(coagulase-positive staphylococci)  選択培地上に定形及び/又は非定

形コロニーを形成し,コアグラーゼ反応陽性反応又はウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地上でウサ

ギ血しょうに特異的凝集反応を示す細菌。

備考  この規格では,強いコアグラーゼ陽性反応によって,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の確認を行

っているが,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌にはコアグラーゼ陽性反応が弱い菌株があることが

確認されている。これらの弱陽性の菌株は他の細菌と混同される可能性があるが,耐熱性ヌク

レアーゼ産生性などの追加試験を行うことによって鑑別できる。

3.2

コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の計数(enumeration of coagulase-positive staphylococci)  試料 1 ml 又

は 1 g 中のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌数は,JIS K 3703-2 に規定する方法に従って求める。

3.3

精製水  JIS K 8008 の 3.2 に規定する A2 の水。

備考  これを超える精製度のものを使用することに関しては制限しない。滅菌水は,イオン交換水の

品質以上のものを乾熱滅菌若しくは蒸気滅菌又はフィルターでろ過し除菌したものとする。ま

た,市販の精製水を用いる場合は,この規格で規定する精製水と同等以上の品質のものとする。

4.  一般原則   
4.1

検出法


3

K 3703-3:2008

4.1.1

液体試料であれば規定量の試料を,他の試料であれば規定量の試料懸濁液(JIS K 3702 参照)を,

選択培地に接種する。

4.1.2

各試験管を 37  ℃で嫌気的に 24 時間及び 48 時間培養する。

培養後に亜テルル酸カリウムの減少

(黒

変又は黒色の沈殿物の生成)が認められる場合,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の存在が推定される。

備考  この規格では,各試験管に寒天又は流動パラフィンを重層して嫌気環境を得る。嫌気状態のジ

ャー又は細菌培養器(6.1)内で試験管を培養する方法もある。

4.1.3 24 時間後,ベアード・パーカー選択寒天培地上に陽性と推定される試験管(4.1.2)の培養液を接

種する。残りの試験管については,いずれも 48 時間後に接種を行う。

4.1.4

試験管(4.2.2)の培養液を接種した各ベアード・パーカー選択寒天培地を 37  ℃で 24 時間及び 48

時間培養する。培養後に亜テルル酸カリウムの減少及び卵黄反応が認められる場合,コアグラーゼ陽性ブ

ドウ球菌の存在を推定できる。

4.1.5

定形及び/又は非定形コロニーについて,コアグラーゼ反応陽性を示すコロニーを確認する。

4.1.6

ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地上に試料を接種してもよい。コアグラーゼ陽性のブドウ

球菌の存在は,適切な培養[JIS K 3703-2 の 9.(実施手順)による。

]後に,ウサギ血しょうフィブリノー

ゲンに特異反応を示すコロニーとして確認できる。

4.1.7

結果は,試料 g 又は x mL 中にコアグラーゼ陽性ブドウ球菌が“陽性”又は“陰性”と記録する。

4.2

生菌数測定法

4.2.1

当該試料の希釈系列(段階希釈試料液)を,液体選択培地に接種する。

4.2.2

各試験管を 37  ℃で嫌気的に 24 時間及び 48 時間培養する。亜テルル酸カリウムの減少が認められ

る場合,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌の存在を推定できる。

備考  この規格では,各試験管に寒天又は流動パラフィンを重層して嫌気環境を得る。嫌気状態のジ

ャー又は細菌培養器(6.1)内で試験管を培養する方法もある。

4.2.3 24 時間後,ベアード・パーカー選択寒天培地上に陽性と推定される試験管(4.2.2)の培養液を接

種する。残りの試験管については,いずれも 48 時間後に接種を行う。

4.2.4

試験管(4.2.2)の培養液を接種した各ベアード・パーカー選択寒天培地を 37  ℃で 24 時間及び 48

時間培養する。培養後に亜テルル酸カリウムの減少及び卵黄反応が認められる場合,コアグラーゼ陽性ブ

ドウ球菌の存在を推定できる。

4.2.5

定形及び/又は非定形コロニーについて,コアグラーゼ反応陽性を示すコロニーを確認する。

4.2.6

菌が確認された希釈試料液(4.2.5 又は 4.1.6)について,試料 1 g 又は 1 mL 当たりのコアグラーゼ

陽性ブドウ球菌の最確数(MPN)を,最確数表(JIS K 3701 参照)を参照して算出する。

5.  希釈液及び培地  JIS K 3701 による。培地及び試薬の調製に用いる素材は,分析用として品質が保証

されているものを使用する。

5.1

希釈液  JIS K 3702 による。

5.2

改変 Giolitti-Cantoni ブロス(ブイヨン又は液体培地)

5.2.1

基礎培地

5.2.1.1  組成  組成は,表 による。



K 3703-3:2008

表 1  基礎培地の組成

2 倍濃度培地

1 倍濃度培地

カゼインの酵素分解物

20.0 g

10.0 g

肉エキス

10.0 g

5.0 g

酵母エキス

10.0 g

5.0 g

塩化リチウム

10.0 g

5.0 g

マンニトール

40.0 g

20.0 g

塩化ナトリウム

10.0 g

5.0 g

グリシン

2.4 g

1.2 g

ピルビン酸ナトリウム

6.0 g

3.0 g

ポリオキシエチレンソルビタン
モノオレエート(Tween 80)

2.0 g

1.0 g

精製水

1 000 mL

1 000 mL

5.2.1.2  調製  各成分を精製水に溶解する。必要に応じて加温・かくはんし,完全に溶解する。室温まで

冷却し,必要であれば滅菌後の最終 pH が 6.9±0.2 となるように pH を調整する。適切な大きさの試験管

(例:1 倍濃度培地の場合 16 mm×160 mm,2 倍濃度培地の場合 20 mm×200 mm)に,培地を適当量分

注する。オートクレーブで 121  ℃,15 分間滅菌する。

5.2.2

亜テルル酸カリウム溶液

5.2.2.1  組成  組成は,表 による。

表 2  亜テルル酸カリウム溶液の組成

亜テルル酸カリウム(K

2

TeO

3

) 1.0

g

精製水 100 mL

5.2.2.2  調製  最小限の加熱で亜テルル酸カリウムを精製水に溶解する。白色の不溶物が精製水中に生じ

た場合は,これを用いない。孔径 0.22

µm のメンブランフィルターを用いてろ過し,除菌する。溶液は 3

±2  ℃で最長 1 か月間保存できる。白色の沈殿物が生じた場合は,溶液を用いない。

5.2.3

完全培地  使用直前に,基礎培地(5.2.1)を 100  ℃で 15 分間加熱し,空気を追い出す。44∼47  ℃

まで冷却し,1 倍濃度培地の場合は試験管 1 本につき 0.1 mL,2 倍濃度培地の場合は試験管 1 本につき 0.2

mL の亜テルル酸カリウム溶液(5.2.2)を無菌操作で加える。

5.2.4

培地の品質保証のための性能  改変 Giolitti-Cantoni ブロス(ブイヨン又は液体培地)の性能基準を,

表 に示す。


5

K 3703-3:2008

表 3  改変 Giolitti-Cantoni ブロス(ブイヨン又は液体培地)の性能基準

機能

培養

品質管理用菌株

対照培地

品質管
理方法

基準

培養能

37  ℃ ,
48 時間

黄色ブドウ球菌 ATCC 
6538 P 若しくは 25923
+競合菌 株(大 腸菌

E. coli)ATCC 8739
若しくは 25922)

,又は

他の菌株 保存機 関に

登録され ている 同じ
菌株

半定量

選 択 培 地
上 の コ ロ
ニ ー 数 が
10 個を超
える。

選択性

37  ℃ ,
48 時間

大腸菌 ATCC 25922 若

しくは 8739,又は菌株
保存機関 に登録 され
ている同じ菌株

TSA 
(トリプト
ソ イ 寒 天
培地)

半定量

選 択 培 地

上 で は ,
発 育 し な
い。

備考  選択性(selectivity)及び培養能(productivity)の定義については,ISO/TS 

11133-2 による。これらの菌株は理化学研究所生物基盤研究部微生物系
統保存施設,独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門など
から購入可能である。

5.3

寒天溶液

5.3.1

組成  組成は,表 による。

表 4  寒天溶液の組成

寒天 15∼20 g

精製水

1 000 mL

備考  寒天の量は,寒天のゲル強度による。

5.3.2

調製  寒天を精製水に懸濁した後,121  ℃で 15 分間オートクレーブにかける。使用前に 44∼47  ℃

まで冷却し,適切な容量の試験管に分注する。保存は,JIS K 3701 に準拠する。

5.4

ベアード・パーカー選択寒天培地

5.4.1

組成及び調製  JIS K 3703-1 による。

5.4.2

培地の性能  ベアード・パーカー選択寒天培地の性能基準を,表 に示す。

表 5  ベアード・パーカー選択寒天培地の性能基準

機能

培養

品質管理用菌株

対照
培地

品質管
理方法

基準及びコロ

ニーの特徴

培養能

37  ℃ ,
24 ∼ 48
時間

黄 色 ブ ド ウ 球 菌
ATCC 6538 若しくは
25923,又は他の菌株
保存機関に登録され
ている同じ菌株

TSA

定量法

P

R

≧0.5。

黒色又は灰色

のコロニーで
透明なハロー
(卵黄反応)

をもつ。

選択性

37  ℃ ,
48 時間

大腸菌 ATCC 25922 若
しくは 8739,又は菌

株保存機関に登録さ
れている同じ菌株

定量法

生育が完全に
阻害されるこ

と。



K 3703-3:2008

表 5  ベアード・パーカー選択寒天培地の性能基準(続き)

特異性

37  ℃ ,
24 ∼ 48
時間

表皮ブドウ球菌 
( S. epidermidis 
ATCC 12228,又は他
の菌株保存機関に登
録されている同じ菌

定量法

黒色又は灰色
のコロニーで
透明なハロー

(卵黄反応)
をもたないも
の。

備考  これらの菌株は理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設,独立

行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門などから購入可能で
ある。

P

R

(培養能指標)は,次の式によって算出する。

o

S

R

N

N

P

=

ここに,  Ns:  1 枚又はそれ以上の試験培地のシャーレに出現したコロニ

ーの総数

No:  1 枚又はそれ以上の対照培地のシャーレに出現したコロニ

ーの総数

5.5

ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地  [参考文献

(6)

及び

(7)

参照]

5.5.1

組成及び調製  JIS K 3703-1 による。

5.5.2

培地の性能  ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地の性能基準を,表 に示す。

表 6  ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地の性能基準

機能

培養

品質管理用菌株

対照
培地

品 質 管
理方法

基準及びコロ
ニーの特徴

培養能

37  ℃ ,
24 ∼ 48
時間

黄 色 ブ ド ウ 球 菌 ( S. 
aureus
)ATCC 6538 若
しくは 6538P,25923,

又は他の菌株保存機
関に登録されている
同じ菌株

TSA

定量法

P

R

≧0.5。

黒色又は灰色
のコロニーで

混濁したハロ
ーをもつ。

選択性

37  ℃ ,
48 時間

大腸菌(E. coli)ATCC 
25922 若しくは 8739,
又は菌株保存機関に
登録されている同じ
菌株

定量法

生育が完全に
阻害される。

特異性

37  ℃ ,
24 ∼ 48
時間

表皮ブドウ球菌 
( S. epidermidis 
ATCC 12228,又は他
の菌株保存機関に登
録されている同じ菌

定量法

黒色又は灰色
のコロニーで

混濁したハロ
ーをもつ。

備考  これらの菌株は理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設,独

立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門などから購入可能
である。

5.6

ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス(ブイヨン又は液体培地)

5.6.1

組成及び調製  JIS K 3703-1 による。


7

K 3703-3:2008

5.6.2

培地の性能  ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロス(ブイヨン又は液体培地)の性能基

準を,

表 に示す。

表 7  ブレインハートインフュージョン(BHI)ブロスの性能基準

機能

培養

品質管理用菌株

対照
培地

品質管
理方法

基準となる混

濁度

培養能

37  ℃ ,
24 時間

黄色ブドウ球菌(S. 
aureus
)ATCC 25923,
又は他の菌株保存機
関に登録されている
同じ菌株

定性法

うっすらと濁
る,又ははっ

きりと濁る。

備考  これらの菌株は理化学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設,独立

行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門などから購入可能で
ある。

5.7

ウサギ血しょう  JIS K 3703-1 による。

6.  装置及び器具  通常の微生物検査用装置及び器具(JIS K 3701 参照),及び次に挙げるものを用いる。

備考  同様の仕様であれば,再利用可能なガラス器具の代わりに使い捨ての器具を使用してもよい。

6.1

細菌培養器  37±1  ℃で操作できるもの。

6.2

乾燥キャビネット又は乾燥器  対流によって換気され,37∼55  ℃を保持できるもの。

備考  層流式キャビネットを使用してもよい。

6.3

シャーレ  滅菌済みのもの。

6.4

白金線  白金・イリジウム合金,ニッケル・クロム合金又はプラスチック製の滅菌済み使い捨てせ

ん(穿)刺接種用ワイヤー。

6.5

白金耳  白金・イリジウム合金,ニッケル・クロム合金又はプラスチック製で,ループの直径が約 3

mm のもの,又は,容量が 10

µL の滅菌済み使い捨てループ。

6.6

試験管  適切な大きさのもの(16 mm×160 mm,20 mm×200 mm,10 mm×75 mm など)。

6.7

目盛付きピペット(メスピペット)  容量が 1 mL で,0.1 mL 単位で目盛られており,流出口径(先

端口径)が適当な大きさもの。

6.8

ウォーターバス  44∼47  ℃及び 37  ℃で操作できるもの。

6.9

薬さじ  寒天を切断するためのもの。

6.10

  嫌気ジャー

7.  サンプリング方法  個別の規格による。

備考  検査対象を真に代表する試料が,輸送中又は保存中に,損傷又は変質を来すことなく,検査室

に届けられることが重要である。個別の規格がない場合には,受渡当事者間の協定による。

8.  試料の調製  個別の規格による。

備考  個別の規格がない場合には,受渡当事者間の協定による。

9.  手順



K 3703-3:2008

9.1

検出法

9.1.1

試料及び試料懸濁液  JIS K 3702 による。試料懸濁液は,試料 1 g 若しくは 1 mL を 1 倍濃度の改

変 Giolitti-Cantoni ブロス(ブイヨン又は液体培地)

5.2)9 g 若しくは 9 mL に,又は試料 10 g 若しくは 10

mL を 2 倍濃度の改変 Giolitti-Cantoni ブロス(ブイヨン又は液体培地)(5.2)10 g 若しくは 10 mL に加えて

調製する(前者では試料 0.1 g 又は 0.1 ml,後者では試料 1 g 又は 1 ml に相当する。

。試料がより大量であ

る場合は,試料 x g 又は x mL を 1 倍濃度の改変 Giolitti-Cantoni ブロス(ブイヨン又は液体培地)

5.2)9 x

g 又は 9 x mL に加える。培地は前もって脱気し,亜テルル酸カリウムを加えておき,フラスコ又は容器内

の空気容量は最小限とする。44∼47  ℃まで冷却した寒天(5.3)又は流動パラフィンを重層して培地上に

慎重に注ぎ,密閉する。

9.1.2

増菌  試料懸濁液(9.1.1)を,37  ℃で 24±2 時間培養する(6.1 参照)。黒変又は黒色の沈殿物が

認められた場合は,9.1.3 に示すように継代培養を行う。黒変を生じなかった場合は,さらに 24±2 時間培

養した後,

(黒変又は黒色沈殿物の発生の有無にかかわらず)9.1.3 に示すように継代培養を行う。

9.1.3

各管の継代培養  滅菌済みの薬さじ(6.9)を用いて重層した寒天又は流動パラフィン(4.1.2 の備

考を参照)を縦に四つに切り,寒天又は流動パラフィンの栓を無菌的に取り除く。必要に応じて,薬さじ

6.9)を栓の周囲に差し込み,試験管のガラス壁からはがす。試験管の内容物をよくかくはんし,培養液

が均質な懸濁液となるようにする。分離コロニーを得るため,滅菌済みの白金耳(6.5)を用いて,選択し

たそれぞれの管の培養液から 1 白金耳量をベアード・パーカー選択寒天培地(5.4)又はウサギ血しょうフ

ィブリノーゲン寒天培地(5.5)の表面上に塗抹する。作製した平板を倒置し,37  ℃に設定した細菌培養

器(6.1)内で 24±2 時間及び 48±2 時間培養する。

9.2

生菌数測定法

9.2.1

試料及び試料懸濁液  JIS K 3702 による。

9.2.2

接種  脱気し,亜テルル酸カリウムを加えた(5.2.3)2 倍濃度培地の試験管 3 本を用意し,液体試

料の場合は試料 10 mL を,他の試料の場合は,試料懸濁液 10 mL(試料 1 g 相当)を各試験管内に入れる。

脱気し,亜テルル酸カリウムを加えた(5.2.3)1 倍濃度培地の試験管 3 本を用意し,液体試料の場合は試

料 1 mL を,他の試料の場合は,試料懸濁液 1 mL(試料 0.1 g 相当)を各試験管内に入れる。以降の各希

釈段階(液体試料の場合は 10

1

,10

2

及び 10

3

,他の試料の場合は 10

2

,10

3

又は 10

4

)についても,

希釈段階ごとに新しい滅菌済みのピペットを用いて上記のように接種を行う。十分な数の希釈段階を設け,

最終希釈段階では 3 本とも陰性結果となるようにする。接種物と培地とを慎重に混合し,いずれにも空気

が混入しないようにする。接種した各試験管内の培地上に,44∼47  ℃まで冷却した寒天(5.3)を栓とな

るように慎重に注ぎ,凝固させて密閉する。

9.2.3

培養  接種した 2 倍濃度又は 1 倍濃度培地の試験管(9.2.2)を,37  ℃で 24±2 時間培養する(6.1

参照)

。黒変又は黒色の沈殿物を呈した試験管は,いずれも継代培養を行う。残りの接種試験管について

は,さらに 24±2 時間培養した後,48±2 時間後に黒色の沈殿物を生じたものと生じなかったものとに

かかわらず,すべての試験管を継代培養する。

9.2.4

継代培養  9.1.3 による。

9.3

平板の選択及び判定

9.3.1

ベアード・パーカー選択寒天培地

9.3.1.1

  コロニーの選択  各平板を 24 時間培養後(9.1.3 又は 9.2.4),存在するすべての定形コロニーの

位置について,平板の底面に印を付ける。

備考1.  定形コロニーは,黒色又は灰色で光沢があり,凸状の形態をもち(24 時間培養後の直径は 1


9

K 3703-3:2008

∼1.5 mm,48 時間培養後の直径は 1.5∼2.5 mm となる。

,部分的に不透明なこともある透明

帯で囲まれている。24 時間以上培養すると,この透明帯の中に,コロニーに直接接触した乳

白色の環が現れることもある。

2.

  非定形コロニーは定形コロニーと同じ大きさをもっており,次に挙げる形態のいずれかを呈

することがある。

a

)  光沢のある黒色のコロニーで,細幅の白色縁を形成することもある。透明帯は  存在し

ないか,わずかに見える程度であり,乳白色の環は存在しないか,ほとんど見えない。

b

)  透明帯の存在しない,灰色のコロニー

非定形コロニーは,乳製品,エビ及び臓物などを汚染しているコアグラーゼ陽性ブドウ球菌株によって

主に形成される。他の試料を汚染しているコアグラーゼ陽性ブドウ球菌株が非定形コロニーを形成する頻

度は低い。

備考 3.  この他のコロニーは,備考 1.及び備考 2.に記述したような定形・非定形外観を呈さずに平板

上に存在する可能性のある残りのコロニーすべてであり,それらはバックグラウンド・フロ

ーラ[微生物そう(叢)

]とみなされる。

全平板を更に 24±2 時間,37  ℃で再度培養し(6.1 参照)

,新たに発育した定形コロニーに印を付ける。

存在する非定形コロニーについても,すべて印を付ける。

9.3.1.2

  確認  9.3.1.1 に従って選択したコロニーの表面から,滅菌した白金線(6.4)で釣菌し,ブレイン

ハートインフュージョンブロス(ブイヨン又は液体培地)

5.6)の入った試験管又は瓶に移す。37  ℃で 24

±2 時間培養する(6.1 参照)

。適切な大きさ(例,10 mm×75 mm)の滅菌済み試験管に入ったウサギ血し

ょう(5.7)0.3 mL(他に製造業者による規定のない限り)に,各培養液 0.1 mL を無菌的に加え,37  ℃で

培養する。試験管を傾けて,培養 4∼6 時間後に血しょう凝固が起こるか否かを調べる。

試験結果が陰性の場合は,24±2 時間の培養後に再検査するか,製造業者の規定する時間で培養した後

に検査を行う。

図 に示す採点指針に従って,3+以上のコアグラーゼ反応が得られた場合は,コアグラーゼ試験陽性と

みなす。1+∼2+の反応は中間とみなす。各回分の血しょうについて,陰性対照として,滅菌したブレイン

ハートインフュージョンブロス(ブイヨン又は液体培地)

5.6)0.1 mL を推奨量のウサギ血しょう(5.7)に

加え,菌を接種せずに培養する。対照血しょうが凝固反応を示さなければ,試験を有効とする。それぞれの

試験管について試験し,1 個以上のコロニーがコアグラーゼ陽性と確認された試験管を,陽性と記録する。

−  陰性:フィブリン形成の形跡なし。

1+  陽性:小さく,まとまりのない凝塊が認められる。 
2+  陽性:小さいがまとまっている凝塊が認められる。 
3+  陽性:大きくまとまっている凝塊が認められる。 
4+  陽性:試験管の全内容物が凝固し,試験管を倒置しても動かない。

  1  コアグラーゼ試験反応の採点方法


10 
K 3703-3:2008

9.3.2

ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地  24±2 時間培養(必要に応じて,更に 24 時間培養す

る。

)すると,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌は,周囲にコアグラーゼ活性を示す析出物のハローを伴った黒

色又は灰色(若しくは,ほぼ白色)の小さなコロニーを形成する。培養初期には,プロテウス(Proteus

属のコロニーが,コアグラーゼ陽性ブドウ球菌のコロニーと同様の外観を呈することがある。しかし,24

時間又は 48 時間の培養後には,幾分茶色がかった拡散コロニーとなるため,ブドウ球菌との識別が可能と

なる。コアグラーゼ活性を示すコロニーが 1 個以上認められれば,試験結果を陽性とする。

備考  ウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地を用いる方法はコアグラーゼ反応に基づいているた

め,コアグラーゼ活性を改めて確認する必要はない。

10.  試験結果の表現   
10.1

  検出法  試験結果の判定に従って,試料中のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の有無を記録する。この

とき,試験試料の質量(g)又は体積(mL)を明記する。

10.2

  生菌数測定法

10.2.1

  希釈段階の選択  接種した液体選択培地における希釈段階ごとに(9.1.2 及び 9.2.2),ベアード・パ

ーカー選択寒天培地による試験(9.3.1)によってコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の存在が確認された試験管

の数,又はウサギ血しょうフィブリノーゲン寒天培地(9.3.2)によってコアグラーゼ反応陽性のコロニー

の存在が確認された試験管の数を記録する。これらを陽性管とする。連続した三つの希釈段階を選択し,

MPN 指数を求める(JIS K 3701 による)。

備考  試料懸濁液及び試料が液体の場合は,これを希釈液とみなす。

10.2.2

  算出法  JIS K 3701 による。

11.  精度  MPN 法では,試験結果に大きな変動が生じる可能性のあることがよく知られている。規定の

信頼限界は,試験結果のランダム分布に完全に基づいている。その他,より重要となり得る変動の原因と

して,MPN 推定には由来しないものがある。こうした影響を見越して,JIS K 3701 

附属書 の表 

カテゴリーを使用する。これは,考えられる試験管の組合せを,その発生確率に準じてまとめたものであ

る。

備考  粉乳試料に関する国際共同試験(参考文献[3]参照)でこの規格に記載した方法と同様の MPN

法を用いて試験を実施したところ,全体の 75  %において,二つの単独試験結果間の差はその

算術平均の 1.25 倍未満であった。

二つの試験結果間に認められた最大差は,

その算術平均の 1.94

倍であった。

12.  試験報告書  試験報告書は,次の事項を明記する。 
a

)  試験試料を完全に特定するために必要な全情報

b

)  使用した試験試料の採取方法(判明している場合)

c

)  使用した試験方法(検出法又は生菌数測定法,及び使用培地)

d

)  この規格で規定していないあらゆる操作又は任意としたあらゆる操作についての詳細,及び試験結果

に影響を及ぼした可能性のある全事象についての詳細

e

)  得られた試験結果(用いた表記方法を明確に示す。)


11

K 3703-3:2008

参考文献

[1] IDF

83:1998,

Milk and milk-based productsDetection of thermonuclease produced by coagulasepositive 

staphylococci in milk and milk-based products

[2] IDF

60C:1997,

Milk and milk-based productsDetection of coagulase-positive staphylococciMost probable 

number technique

[3]  Chopin, A., Malcolm, S., Jarvis, G., Asperger, H., Beckers, H.J., Bertona, A.M., Cominazzini, C., Carini, S.,

Lodi, R., Hahn, G., Heeschen, W., Jans, J.A., Jervis, D.l., Lanier, J.M., O'Connor, F., Rea, M., Rossi, J.,

Seligmann, R., Tesone, S., Waes, G., Mocquot, G. and Pivnick, H. Comparison of four media and methods for

enumerating Staphylococcus aureus in powdered milk: ICMSF Methods Studies: XV. J. Food. Prot., 48,1985,

pp. 21-27

[4]  Baird-Parker, A.C. An improved diagnostic and selective medium for isolating coagulase positive

staphylococci, J. Applied Bacteriology, 25(1), 1962, pp. 12-19

[5]  Smith, B.A. and Baird-Parker, A. C. The use of sulphamezathine for inhibiting Proteus spp. on Baird-Parker's

isolation medium for Staphylococcus aureusJ. Applied Bacteriology, 27(1), 1964, pp. 78-82

[6] Beckers,

H.L.

et al. Evaluation of a pour-plate system with rabbit plasma-bovine fibrinogen agar for the

enumeration of Staphylococcus aureus in food. Can. J. Microbiol., 30, 1984, pp.470-474

[7]  Sawhney, D. The toxicity of potassium tellurite to Staphylococcus aureus in rabbit plasma fibrinogen agar, J. 

Applied Bacteriology, 61,1986, pp. 149-155


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K 3703-

3

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附属書(参考)JIS と対応する国際規格との対比表

JIS K 3703-3:2008  コアグラーゼ陽性ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌など)の菌数測定
方法−第 3 部:低菌数の検出法及び最確数(MPN)法による生菌数測定法

ISO 6888-3:2003  食品及び動物用飼料の微生物試験−コアグラーゼ陽性ブドウ
球菌(黄色ブドウ球菌など)の菌数測定方法−第 3 部:検出法及び低菌数 MPN

(Ⅰ) JIS の規定

(Ⅲ) 国際規格の規定

(Ⅳ) JIS と国際規格との技術的差異の項目ごと
の評価及びその内容

  表示箇所:本体 
  表示方法:点線の下線

項目番号

内容

(Ⅱ) 国際
規格番号

項目番号

内容

項目ごとの

評価

技術的差異の内容

(Ⅴ) JIS と国際規格との技術的
差異の理由及び今後の対策

1.適用範囲

培 地 を 用 い て 低 菌 数

の コ ア グ ラ ー ゼ 陽 性
ブ ド ウ 球 菌 を 検 出 す
る方法について規定。

ISO 
6888-3 

1

JIS とほぼ同じ。

MOD/削除 
 
MOD/追加

培地試験方法に限定 
 
黄色ブドウ球菌を追加

工業標準化法の対象とならな

い事項を削除 
利用者の利便性のため。実質的
な差異はない。

JIS K 3701 
JIS K 3702 
JIS K 3703-1 
JIS K 3703-2 

ISO 7218 
ISO 6887-1 
ISO 6888-1 
ISO 6888-2 

IDT

 
ISO/TS 11133-2 

ISO 8261 
ISO/TS 11133-2 

MOD/削除 
IDT

 

食品は適用範囲外であるため。

2.引用規格

JIS K 8008 

2

 

MOD/追加

 

追加した用語を規定するため。

3.定義

用語の定義を規定

3

JIS とほぼ同じ。

MOD/追加

用語(水)を追加。

JIS として必要な用語を規定。 

4.一般原則

コ ア グ ラ ー ゼ 陽 性 ブ
ド ウ 球 菌 検 出 の た め
の操作を規定。

 4 JIS とほぼ同じ。

MOD/追加 

参照規格を追加

利用者の利便性のため。技術的
な差異なし。

5.希釈液及び
培地

培地及び試薬(ベアー
ド・パーカー選択寒天

培 地 及 び ウ サ ギ 血 し
ょ う フ ィ ブ リ ノ ー ゲ
ン寒天培地など)につ

いて規定。

5

JIS とほぼ同じ。

MOD/追加 
 
MOD/追加 
 
MOD/変更 

菌株の入手先を追記(

表 など)

 
培地の性能基準表(

表 5,表 6

表 7)を追記。 
水の温度(沸騰水を精製水)を

変更(5.3.2

利用者の利便性のため。技術的
な差異なし。

利用者の利便性のため。技術的
差異はない。 
利用者の安全のため。


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3

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(Ⅰ) JIS の規定

(Ⅲ) 国際規格の規定

(Ⅳ) JIS と国際規格との技術的差異の項目ごと
の評価及びその内容 
  表示箇所:本体

  表示方法:点線の下線

項目番号

内容

(Ⅱ) 国際
規格番号

項目番号

内容

項目ごとの
評価

技術的差異の内容

(Ⅴ) JIS と国際規格との技術的
差異の理由及び今後の対策

6.装置及び器

通 常 の 微 生 物 検 査 に
用 い る 装 置 及 び ガ ラ

ス器具(細菌培養器及
び 乾 燥 キ ャ ビ ネ ッ ト
など)について規定。

 6 JIS とほぼ同じ。

MOD/追加 
 
MOD/変更

6.4 及び 6.5 に装置(白金線及び
白金耳)を追加。

表 3 記載の菌株番号

(ATCC8739)

を変更。

利用者の利便性のため。技術的
差異はない。

原規格の誤記載(ATCC8732)
を訂正。

7.サンプリン
グ方法

試 料 の サ ン プ リ ン グ
方法について規定。

 7 JIS と同じ。 IDT

8.試料の調製

試 料 の 調 製 に つ い て
規定。

 8 JIS と同じ。 IDT

9.手順

手順(試料,試料懸濁
液,増菌及び生菌数測
定法など)について規

定。

 9 JIS とほぼ同じ。

MOD/変
更・追加 
 
MOD/追加

9.1.1 パラフィンを流動パラフィ
ンに変更し,調整方法を具体的
に記載。 
9.1.3 懸濁液の調製条件(試験管
の内容物をよくかくはん)を追
記。

利用者の利便性のため。

10. 試 験 結 果
の表現

試験結果の表現(コア
グ ラ ー ゼ 陽 性 ブ ド ウ

球菌の有無など)につ
いて規定。

 10

JIS と同じ。 IDT

11.精度

試 験 結 果 に 大 き な 変
動 が 生 じ る 可 能 性 の
あ る 精 度 に つ い て 規

定。

 11

JIS と同じ。 IDT

12. 試 験 報 告

試験報告書(使用培地

及び試験結果など)に
ついて規定。

 12

JIS と同じ。 IDT


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JIS と国際規格との対応の程度の全体評価:MOD 
 
備考1.  項目ごとの評価欄の記号の意味は,次のとおりである。

    ―  IDT……………… 技術的差異がない。

―  MOD/削除……… 国際規格の規定項目又は規定内容を削除している。

    ―  MOD/追加………  国際規格にない規定項目又は規定内容を追加している。 
    ―  MOD/変更………  国際規格の規定内容を変更している。 
2.  JIS と国際規格との対応の程度の全体評価欄の記号の意味は,次のとおりである。 
    ―  MOD……………  国際規格を修正している。