>サイトトップへ >このカテゴリの一覧へ

K 0464

:2009

(1)

目  次

ページ

序文 

1

1

  適用範囲

1

2

  引用規格

1

3

  用語及び定義 

1

4

  原理

2

5

  測定方法の種類 

3

5.1

  フロー式免疫測定方法 

3

5.2

  バッチ式免疫測定方法 

3

6

  試薬

3

7

  器具及び機器 

4

8

  サンプリング,前処理及び試料調製 

4

8.1

  サンプリング 

4

8.2

  前処理

4

8.3

  標準液の調製 

4

8.4

  試料調製 

4

9

  測定操作

4

9.1

  フロー式免疫測定方法 

4

9.2

  バッチ式免疫測定方法 

5

10

  分析方法のバリデーション(妥当性確認)

5

10.1

  一般

5

10.2

  精度プロファイル

5

10.3

  定量下限及び定量上限 

6

10.4

  検出下限 

7

10.5

  他の分析方法との比較 

7

11

  計算 

7

11.1

  繰返し測定 

7

11.2

  検量線

7

11.3

  測定試料の定量 

8

12

  日常精度管理 

9

12.1

  一般

9

12.2

  操作ブランク試料

9

12.3

  濃度既知試料 

9

12.4

  二重測定 

9

12.5

  管理図

9

13

  検査報告書 

9


K 0464

:2009  目次

(2)

ページ

附属書 A(参考)サンプリング及び前処理 

11

附属書 B(参考)フローチャート 

14

附属書 C(参考)免疫測定方法(イムノアッセイ)の分類 

16


K 0464

:2009

(3)

まえがき

この規格は,工業標準化法に基づき,日本工業標準調査会の審議を経て,経済産業大臣が制定した日本

工業規格である。

この規格は,著作権法で保護対象となっている著作物である。

この規格の一部が,特許権,出願公開後の特許出願,実用新案権又は出願公開後の実用新案登録出願に

抵触する可能性があることに注意を喚起する。経済産業大臣及び日本工業標準調査会は,このような特許

権,出願公開後の特許出願,実用新案権及び出願公開後の実用新案登録出願にかかわる確認について,責

任はもたない。


日本工業規格

JIS

 K

0464

:2009

ポリクロロビフェニル (PCB) の免疫測定方法通則

Guidelines for PCB immunoassay

序文 

免疫測定方法は,測定対象成分の濃度を定量するために,測定対象成分に対して調製された抗体を用い

て,抗原抗体反応の特異性に基づいて測定を行う方法である。これらの免疫測定方法は,スクリーニング

用の測定手法として有用である。

ポリクロロビフェニル (PCB) を検出する免疫測定方法は数多くあり,測定原理及び検出方法は共通す

るところが多いことから,これらを通則として規定した。

なお,対応国際規格は現時点で制定されていない。

適用範囲 

この規格は,産業活動によって生じるポリクロロビフェニル(以下,PCB という。

)製剤によって汚染

された廃油,排水,汚泥,土壌,底質などに含まれる PCB を免疫測定によって定量する方法の通則につい

て規定する。

引用規格 

次に掲げる規格は,この規格に引用されることによって,この規格の規定の一部を構成する。これらの

引用規格は,その最新版(追補を含む。

)を適用する。

JIS K 0093

  工業用水・工場排水中のポリクロロビフェニル (PCB) 試験方法

JIS K 0461

  競合免疫測定方法通則

JIS K 0462

  非競合免疫測定方法(サンドイッチ法)通則

JIS K 0557

  用水・排水の試験に用いる水

JIS K 0970

  プッシュボタン式液体用微量体積計

JIS K 3600

  バイオテクノロジー用語

JIS K 9702

  ジメチルスルホキシド(試薬)

JIS Z 9021

  シューハート管理図

用語及び定義 

この規格で用いる主な用語及び定義は,JIS K 0093JIS K 0461JIS K 0462JIS K 3600 及び JIS Z 9021

によるほか,次による。

3.1 

磁性体 

磁性をもった物質。例えば,磁性体ビーズがある。抗体などの標識及び検出に用いる。


2

K 0464

:2009

3.2 

金コロイド粒子 

数ナノメートルから数百ナノメートルまでの金粒子。抗体などの標識及び検出に用いる。

3.3 

キャリア 

取扱いの容易さ又は抗原性の向上などを目的として,抗原となる物質に結合するたん白質などの生体物

質又は化学物質。

3.4 

抗 PCB 抗体 

PCB に類似の構造をもつ化学物質をハプテンとして用いて動物を免疫するなどによって調製した,測定

対象成分である PCB に高い親和性をもつ免疫グロブリン。一次抗体として用いる。

3.5 

交差抗原 

抗 PCB 抗体に親和性をもつ化学物質のうち,ハプテン以外の化学物質。一般に抗体は,免疫原として用

いたハプテンだけでなく,類似した構造をもつ化学物質にも親和性をもつ。測定対象である PCB は交差抗

原に含まれる。

3.6 

トレーサー 

抗体,交差抗原などを検出又は定量するために用いる物質。例えば,蛍光物質,金コロイド粒子,磁性

体ビーズ,酵素。

注記  JIS K 0461 では,この物質で標識した抗体及び抗原をトレーサーと定義している。

3.7 

抗体トレーサー 

抗体に,これを検出するためのトレーサーを付加したもの。

注記  JIS K 0461 では同物質を標識抗体と定義している。

3.8 

抗原トレーサー 

ハプテン又は交差抗原に,これを検出するためのトレーサーを付加したもの。

3.9 

抗原−キャリア結合体 

ハプテン又は交差抗原に,キャリアを結合させたもの。

原理 

PCB の免疫測定方法は,抗 PCB 抗体の抗原結合部位を占有した PCB を,トレーサーを用いて検出する

ことによって,試料中の PCB 濃度を測定する免疫化学測定方法である。この規格では,PCB の免疫測定

方法をフロー式免疫測定方法とバッチ式免疫測定方法とに類別する。

なお,両方法とも試料の定量は,既知濃度の標準物質溶液を用いて行い,試料濃度を標準物質相当濃度

として算出する。


3

K 0464

:2009

測定方法の種類 

5.1 

フロー式免疫測定方法 

フロー式免疫測定方法は,抗 PCB 抗体と試料中の PCB との反応を行った後,その反応液を検出系に通

液し,抗原−キャリア結合体などを固定した固相(ヘテロジニアス免疫測定方法で使用する,プラスチッ

ク,ガラス,磁性体,メンブレンなどの担体)上で,PCB と反応した抗 PCB 抗体及び未反応の抗 PCB 抗

体を分離し,固相に捕そくした双方又はいずれかの抗 PCB 抗体量を測定し,試料中の PCB 濃度を求める

方法である。定量ポンプなどによって通液制御を行うフロースルー形と,毛細管現象を利用して固相上に

展開するラテラルフロー形とに大別できる(測定対象成分が PCB に限らないが,フロースルー形の手法及

び適用例については[1]及び[2]を,ラテラルフロー形の手法及び適用例については[3]及び[4]を参照)

5.2 

バッチ式免疫測定方法 

バッチ式免疫測定方法は,同一固相上で抗 PCB 抗体と,PCB 及び抗原トレーサー又は抗原−キャリア

結合体などとの競争的結合反応を行った後,固相上に捕そくした抗原−抗 PCB 抗体結合体量を,トレーサ

ーを用いて測定し,試料中の PCB 濃度を求める方法である。固定した抗 PCB 抗体及び抗原トレーサーを

用いる直接免疫測定方法,又は固定した抗原−キャリア結合体などと抗体トレーサーとを用いる間接免疫

測定方法に大別できる。トレーサーに酵素(西洋ワサビペルオキシダーゼ,アルカリフォスファターゼ,

β-D-ガラクトシダーゼなど)を用いる方法を通常,ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)  という。

a)

直接免疫測定方法  抗 PCB 抗体を固定した固相に PCB と抗原トレーサーとを添加し,競合反応を行

った後,抗 PCB 抗体に結合した抗原トレーサー量を測定し,試料中の PCB 濃度を求める方法である。

b)

間接免疫測定方法  抗原−キャリア結合体などを固定した固相に抗 PCB 抗体と PCB とを添加し競合

反応を行った後,固相に捕そくした抗 PCB 抗体の量を抗体トレーサーによって測定し,試料中の PCB

濃度を求める方法である。

試薬 

測定に用いる試薬は,次による。ただし,これ以外に必要となる試薬は,高純度の試薬を用い,空試験

などによって測定に支障のないことを確認した後に使用する。使用する試薬の保存条件及び安定性に関す

る情報は,供給元による。

6.1 

水  JIS K 0557 に規定する A4 若しくは A3 の水,又は同等の品質のもの。

6.2 

ジメチルスルホキシド (DMSO)  JIS K 9702 に規定するもの,又は同等の品質のもの。 

6.3 

標準物質  組成及び濃度が可能な限り国家計量標準にトレーサブルな PCB 標準物質。例えば,独立

行政法人産業技術総合研究所認証標準物質 NMIJ CRM4206a∼NMIJ CRM4211a。

6.4 

環境組成標準物質  PCB の組成及び濃度が可能な限り国家計量標準にトレーサブルな測定対象と類

似の組成物。例えば,独立行政法人産業技術総合研究所認証標準物質 NMIJ CRM7902a 絶縁油(ポリクロ

ロビフェニル分析用−高濃度)

,NMIJ CRM7903a 絶縁油(ポリクロロビフェニル分析用−低濃度)

,NMIJ

CRM7904a 重油(ポリクロロビフェニル分析用−高濃度),NMIJ CRM7905a 重油(ポリクロロビフェニル

分析用−低濃度)

,NMIJ CRM7304a 海底質(ポリクロロビフェニル分析用−高濃度)

,NMIJ CRM7305a 海

底質(ポリクロロビフェニル分析用−低濃度)

6.5 

緩衝洗浄液  緩衝液には JIS K 0461 に規定した PBS,又は同等の品質のものを用いる。緩衝洗浄液

には,抗体の非特異的反応抑制効果をもつ物質(例えば,界面活性剤など)を必要に応じて添加する。


4

K 0464

:2009

器具及び機器 

測定に用いる器具及び機器は,次による。器具及び機器は,空試験などによって測定に支障のないこと

を確認した後使用する。

7.1 

プッシュボタン式液体用微量体積計  JIS K 0970 に規定するもの(マイクロピペットともいう。)。 

7.2 

検出器  蛍光強度,吸光度,磁性量などを測定することで,抗体トレーサー又は抗原トレーサーを

定量できる装置。

サンプリング,前処理及び試料調製 

8.1 

サンプリング 

サンプリングを行う試料媒体,目的に応じた採取量及び採取時間などを十分考慮して代表試料を採取す

る。その例を

附属書 に示す。

8.2 

前処理 

採取した試料は,抽出及びクリーンアップによって,PCB の定量に影響を及ぼす物質を除去する。その

例を

附属書 に示す。

8.3 

標準液の調製 

標準物質を,抗 PCB 抗体を含む測定溶媒と均一な混合が可能な DMSO などの溶媒に溶かして溶解希釈

し,標準希釈列を調製する。

8.4 

試料調製 

試料の前処理によって得られた PCB を含む溶液は,標準液の調製と同一の溶媒に置換する。

測定操作 

9.1 

フロー式免疫測定方法 

9.1.1 

一般 

測定操作方法を,9.1.29.1.8 に示すが,これに限定するものではない。具体的な測定操作は,技術提供

元の技術情報によって実施する。その例を

附属書 に示す。

9.1.2 

抗原抗体反応 

PCB の標準液又は試料と,緩衝液及び適切に希釈又は溶解した抗体トレーサーとを所定の容器中で混合

し,PCB と抗 PCB 抗体との結合が平衡状態に達するまで行う。トレーサーは,抗 PCB 抗体に直接結合し

ている場合と,二次抗体に結合している場合とがある。二次抗体トレーサーを使用する場合には,未標識

の抗 PCB 抗体と二次抗体トレーサーとを同時に混合するか,又は順次反応する。

9.1.3 

通液・展開 

抗原を固定した固相(材質及び機能によって,測定セル,メンブレンなどということがある。

)に対して,

PCB−抗 PCB 抗体反応液を通液又は展開する。フロースルー形の場合は,定量ポンプを用いて反応液を固

相に一定の流量で通液するのに対し,ラテラルフロー形の場合は,毛細管現象を利用して反応液を固相上

に展開する。

9.1.4 

抗体捕そく 

未反応抗 PCB 抗体を,固相に固定した抗原−キャリア結合体などに捕そくする。ラテラルフロー形では,

抗原−キャリア結合体による未反応抗 PCB 抗体の捕そくに加え,抗原−キャリア結合体より下流域に固定

した二次抗体によって,PCB が結合した抗 PCB 抗体を捕そくする。


5

K 0464

:2009

9.1.5 

洗浄・(乾燥) 

フロースルー形では,定量ポンプを用いて緩衝洗浄液を通液し,固相に残存する反応液を洗浄する。洗

浄後,必要に応じて固相を乾燥する。

9.1.6 

検出のための反応 

使用するトレーサーが酵素の場合は,適切な基質溶液を通液又は展開する。

9.1.7 

検出 

固相に結合した抗体トレーサーの量を,各トレーサーに適した検出装置で測定する。

9.1.8 

再生 

フロースルー形の一部の固相は,再生が可能なものがある。その場合は,再生液を通液することによっ

て固相に捕そくした抗 PCB 抗体を解離した後,緩衝液を通液し,固相を抗 PCB 抗体結合前の状態に復帰・

再生する。

9.2 

バッチ式免疫測定方法 

9.2.1 

一般 

バッチ式免疫測定方法のうち,トレーサーとして酵素を用いた場合の一つの方法である直接酵素免疫測

定方法の測定操作方法は,JIS K 0461 による。トレーサーとして酵素を用いた場合の別の方法である間接

酵素免疫測定方法の測定操作方法を,次に規定するが,これに限定するものではない。具体的な操作は,

技術提供元の技術情報によって行う。その例を

附属書 に示す。

9.2.2 

一次抗原抗体反応 

PCB の標準液又は試料及び抗 PCB 抗体(一次抗体)を抗原−キャリア結合体を固定した固相に添加す

る。抗原抗体反応が完了するまで反応を行う。

9.2.3 

洗浄 

緩衝洗浄液で洗浄して,固相に結合しなかった成分を除去する。

9.2.4 

二次抗原抗体反応及び洗浄 

固相に二次抗体トレーサー溶液を添加し反応を行う。その後,未反応物質を緩衝液で洗浄し除去する。

9.2.5 

検出のための反応 

抗体トレーサーの酵素に対応した基質溶液を固相に添加し反応を行う。

9.2.6 

検出 

適切な検出装置を用いて,酵素反応生成物ごとに決められた検出方法によって酵素活性を測定する。

10 

分析方法のバリデーション(妥当性確認) 

10.1 

一般 

データの質を保証するために,新たに導入した免疫測定方法では,分析方法のバリデーション(妥当性

確認)を実施し,10.210.4 に示した方法によって,精度プロファイルを作成し,定量範囲(定量下限及

び定量上限)及び検出下限を求める。

10.2 

精度プロファイル 

分析値の変動係数  [CV  (r

c

)]  を測定対象成分の濃度に対してプロットした図を,精度プロファイルと定

義する([5]参照)

。精度プロファイルには,測定値の CV のプロット及び定量値の CV のプロットの 2 種類

がある。PCB の免疫測定方法の代表的な精度プロファイルを,

図 に示す。


6

K 0464

:2009

図 1−精度プロファイル及び検量線(フロー式免疫測定方法の例)

測定値の CV (r

m

)  から定量値の CV (r

c

)  への変換は,検量線の微分係数  (

dX

dY /

)

を用いて,標準偏差

(SD)

間の変換を行って,

図 に示すように行う。

図 2−測定値の CV (r

m

)

から定量値の CV (r

c

への変換

この変換は,次の式による。

X

dX

dY

Y

r

r

)

/

(

m

c

=

ここに,

X

定量値

Y

測定値

r

c

定量値の

CV

r

m

測定値の

CV

10.3 

定量下限及び定量上限 

定量下限とは,

試料に含まれる分析対象成分の定量が可能な最小量又は最小濃度であり,定量上限とは,

定量が可能な最大量又は最大濃度である。定量値の

CV  (r

c

)

10

%を示す分析対象成分の量又は濃度を,

それぞれ定量下限及び定量上限とする。

図 は,図 で示した定量値の精度プロファイルから求めた。

Y

×

dX

dY /

÷

X

÷

定量値の

CV (r

c

)

定量値の

SD

測定値の

CV (r

m

)

測定値の

SD


7

K 0464

:2009

図 3−定量下限及び定量上限の求め方

10.4 

検出下限 

検出下限とは,試料に含まれる分析対象成分の検出可能な最低の量又は濃度である。

図 に示すように

定量値の

CV (r

c

)

30

%を示す目的値の量又は濃度を検出下限とする。ただし,検出下限は,精度プロフ

ァイルの

U

字曲線の低濃度側とする。

図 4−検出下限の求め方

10.5 

他の分析方法との比較 

既に分析方法(

GC-MS

など)がある場合は,それらの方法と比較を行うとよい。具体的には同一の標準

品,又は値の異なる幾つかの試料を用いて測定を行い,既存測定方法との相関性を明らかにしておく。

11 

計算 

11.1 

繰返し測定 

目的によって異なるが繰返し測定を実施する場合は,定量値の変動係数

  [CV (r

c

)]

10

%以下となるよ

うに行うのがよい。望ましい

CV

によって繰返し数を定める。各濃度の

CV

は,

図 の精度プロファイル

から求め,これから繰返し数を決定する。

11.2 

検量線 

通常,市販のキットには計算方法の選択の指針が付けられている(例えば,

4-parameter logistic

回帰,直

線回帰,

point to point

回帰,

log-logit

回帰,

log-log

回帰など)のでその方法に従う。検量線の関数を得る

のによく用いる例(

4-parameter logistic

回帰)を

図 に示す(

[6]

参照)


8

K 0464

:2009

+

+

=

b

d

a

d

y

50

IC

1

ρ

ρ

ここに,

y

測定値

d

曲線における上方漸近値

a

曲線における下方漸近値

ρ:

標準物質の質量濃度

ρ

IC50

IC

50

における標準物質の質量濃度

b

IC

50

における曲線の傾き

図 5−検量線の例

11.3 

測定試料の定量 

通常,測定試料は希釈系列を調製し,測定する。この測定試料液から得た測定値から算出した

B/B

0

値を

検量線の回帰式に代入し,測定試料液の定量値

C  (μg/mL)

を算出する。試料量当たりの定量値

C

s

mg/kg

など)は,次の式で求める。濃度は,通常,

3

けた目を四捨五入し,有効数字は

2

けたで表す。ただし,

検出下限の位までとする。

S

V

V

v

n

C

C

1

E

E

s

×

×

×

×

=

ここに,

C

s

試料量当たりの定量値(mg/kg など)

C

測定試料液の希釈液の定量値  (μg/mL)

n

希釈倍数

v

測定試料液の液量 (mL)

V

E

抽出液量 (mL)

V'

E

抽出液分取量 (mL)

S

試料の採取量(g など)

試料の定量下限は,測定試料液の希釈倍数,分析に供した抽出液の割合及び試料の採取量によって異な

るので,試料ごとに求める。


9

K 0464

:2009

12 

日常精度管理 

12.1 

一般 

試料の前処理の精度及び測定の精度を確保していることの確認を行うため,次の 12.2 及び 12.3 の試料に

ついて必要な前処理及び試料調製を行って,測定を行う。また,適切な頻度で,12.4 に規定する二重測定

を行い,12.5 に規定する管理図を作成し,記録する。

12.2 

操作ブランク試料 

操作ブランク試料の調製は,測定試料の調製などに起因する汚染を確認し,試料の測定に支障のない測

定環境を確認するために行うものであり,試料のサンプリング及び前処理に用いるのと同じ試薬などを用

いて試料と同様に行う。試薬,資材の変更など前処理操作に大きな変更があった場合及び試料間汚染(ク

ロスコンタミネーション)が予想される高濃度試料の前処理を行う場合にも,操作ブランク試料を調製す

る。操作ブランク試料測定値(以下,操作ブランク測定値という。

)が高い場合は,試料測定値の補正に操

作ブランク測定値を用いる必要があるが,操作ブランク測定値が大きいと,試料測定値の信頼性が低下す

るため,操作ブランク測定値は極力低減を図る。

12.3 

濃度既知試料 

標準的な濃度既知試料(標準物質溶液,濃度既知の環境試料など)であり,適切な頻度(例えば,一連

の分析操作ごと)で,前処理から測定までの工程に精度管理上の問題が発生していないことを,定期的に

確認するために用いる試料である。抽出及び前処理操作における十分な回収率を確認する目的では,通常,

定量下限以上の濃度既知試料を用いる。一方,前処理操作における十分な精製度を確認する目的では,検

出下限以下の濃度既知試料を用いて測定を行い,検出下限値を超えないことを確認する。また,測定系(測

定,定量操作)の異状の有無を確認する目的では,通常,標準物質溶液又は濃度既知の前処理済み試料を

用いる。

12.4 

二重測定 

同一試料から二つ以上の測定試料を採取し,採取した試料について前処理操作,測定操作を行い,定量

下限以上の測定値について,十分な再現性のあることを確認する。測定試料数に応じ適切な頻度で二重測

定を行う。

12.5 

管理図 

検量線作成用標準液及び濃度既知試料の測定値については,一連の測定操作ごとに JIS Z 9021 に規定し

た管理図に測定値を記録し,保存する。管理図による処置基準は,管理限界(μ±3

σ

)からの逸脱状況及

び管理図の傾向に応じて適切に定める(μ:工程平均,

σ

:定量値の標準偏差)

。1 点でも管理限界を超え

た場合は,原因の究明及び対策を行うとともに,試料を再測定する。改善のために講じた措置及び再測定

の結果について,記録を行う。また,警戒限界(μ±2

σ

)内であっても基準値に対して,一定の傾向で外

れていくような状態又は偏った定量値が続くような状態においても原因の究明を行い,必要に応じ対策を

行うとともに,試料を再測定する。

なお,管理限界は,あらかじめ十分なサンプル数から求める。

13 

検査報告書 

検査報告書には,次の事項について明記する。

a)

この規格の番号

b) 

試料を特定するために必要な情報

c) 

選択した免疫測定方法及び測定条件


10

K 0464

:2009

d) 

試料のサンプリング及び前処理方法

e) 11.2

に規定する標準溶液の検量線

f)

11.3

の試料測定結果及び計算結果

g) 

箇条 12 に規定する日常精度管理データ(必要に応じて記載)

h) 

箇条 10 に規定する精度プロファイル(必要に応じて記載)

i) 

検査に用いた抗 PCB 抗体の交差反応性(必要に応じて記載)

j) 

この手順からの逸脱及び結果に影響を及ぼす可能性のあるすべての状況の記載


11

K 0464

:2009

附属書 A

(参考)

サンプリング及び前処理

A.1 

サンプリング及び前処理 

試料媒体は,ポリクロロビフェニル (PCB) を含む油分であり,電気絶縁油,燃料油,潤滑油,非鉱油

などがある。また,試料媒体が使用された電気工作物としては,変圧器,コンデンサ,計器用変成器,リ

アクトル,放電コイル,電圧調整器,整流器,開閉器,遮断器,中性点抵抗器,避雷器,OF ケーブルな

どがある。このほかに蛍光灯安定器などの家電機器がある。

サンプリング方法については,対応する JIS 又は公的な分析マニュアルはないが,試料が含まれる工作

物又は機器の構造及び大きさに適した方法で行う。例えば,試料が密閉されている場合には同じ工作物又

は機器であっても,密閉箇所ごとに採取する。また,密閉量が多量である工作物又は機器の場合,使用時

などに密閉空間において混合が十分行われていることを考慮して代表試料を採取する。

前処理についても,対応する JIS 又は公的な分析マニュアルはないが,試料媒体として油分を対象とし

た方法として“特別管理一般廃棄物及び特別管理産業廃棄物に係る基準の検定方法(厚生告示 192 号平成

4 年 7 月 3 日)”がある。

なお,前処理におけるサンプリングスパイク,クリーンアップスパイクなどの内標準物質については,

免疫測定方法では測定対象成分との識別が不可能であるため使用することはできない。しかし,測定対象

成分の回収性について,濃度既知試料を免疫測定方法を用いて測定することによって,又は内標準物質を

用いた機器分析による測定を行うことによって確認を行う。

A.2 

サンプリングの例 

A.2.1 

サンプリング概要 

電気工作物又は家電機器などから試料を採取する。採取に当たっては,試料の種類,採取場所,採取方

法などに留意する。試料採取の一般事項は,JIS C 2101 を参考にする。

A.2.2 

サンプリング器具及び装置並びにその適用 

試料採取器具及び装置並びにその適用例は,JIS C 2101 の 5.1.1

表 2)を参考にする。ただし,試料に

PCB が含まれる可能性があるため,細管式採取器などの洗浄可能で簡素,かつ,機能的な器具を使用する。

また,試料が密閉形容器又は機器であり,試料の排出口が設けられている場合には,排出口から直接試料

の採取を行う。さらに,循環ラインなどに排出口が設けられている場合も直接試料の採取ができる。

A.2.2.1 

器具 

容器及びふたは,JIS C 2101 の 5.2.1(容器及びふた)に規定したものを用いる。容器はガラス瓶などの

洗浄が可能で油中の PCB が付着しにくい材質のものを用いる。ふたも試料を汚染しない材質及び PCB の

付着性が低い材質のものを用い,容器を密栓して外気と遮断できるものとする。

A.2.2.2 

試料採取器及び装置 

試料採取器及び装置は,JIS C 2101 の 5.2.2(試料採取器及び装置)に従ったものを用いる。ただし,細

部の形状及び寸法は,採取場所の状況に応じて,適宜,選ぶ。

A.2.3 

試料の採取量 

試料は,代表性を損なわない量を採取する。


12

K 0464

:2009

A.2.4 

試料のラベル 

JIS C 2101

の 5.1.3(ラベルの表示)に従った方法による。

A.3 

試料の前処理の例 

A.3.1 

概要 

採取した試料は,A.3.4 の前処理操作に供し,測定試料を調製する。操作は,ヘキサン及び DMSO によ

る抽出・分配と硫酸などによる分解反応とを組み合わせた精製工程から構成する。

なお,これらの操作は,バッチ処理又はカラムクロマトグラフィーのどちらの形態を用いてもよい。

A.3.2 

試薬 

試薬は,JIS に規定されているもので試験に支障のないものを用いる。JIS に規定されていない試薬は,

試験に支障のないものを用いる。

A.3.2.1 

ヘキサン  JIS K 8825 に規定するもの,又は同等の品質のもの。 

A.3.2.2 DMSO

  JIS K 9702 に規定するジメチルスルホキシド,又は同等の品質のもの。 

A.3.2.3 

硫酸  JIS K 8951 に規定するもの,又は同等の品質のもの。 

A.3.2.4 

発煙硫酸  JIS K 8741 に規定するもの,又は同等の品質のもの。 

A.3.2.5 

硝酸銀  JIS K 8550 に規定するもの,又は同等の品質のもの。 

A.3.2.6 PCB

混合物標準品  組成及び濃度が可能な限り国家計量標準にトレーサブルな PCB 標準物質。

例えば,独立行政法人産業技術総合研究所認証標準物質 NMIJ CRM4206a∼NMIJ CRM4211a。 

A.3.2.7 PCB

標準溶液  PCB 混合物標準品を DMSO 又は JIS C 2320 に規定する電気絶縁油などの適切な

溶媒を用いて溶解希釈し,標準希釈列を調製する。

A.3.3 

器具及び装置 

前処理に用いる器具及び装置は,次による。また,市販の専用前処理キット又は専用前処理装置を用い

る場合は,添付文書又は取扱説明書に記載された内容による。

A.3.3.1 

ガラス器具  JIS R 3503 及び JIS R 3505 に準じたものを用いる。 

A.3.3.2 

安全キャビネット  JIS K 3800 に規定するもの,又は同等以上の性能をもつもの。 

A.3.3.3 

プッシュボタン式液体用微量体積計  JIS K 0970 に規定するもの(マイクロピペットともいう。)。 

A.3.4 

前処理操作 

前処理操作は,例えば,次の操作の組合せによって行う。また,市販の専用前処理キット又は専用前処

理装置を用いる場合は,添付文書又は取扱説明書に記載された操作内容による。

a)

試料の希釈  試料をヘキサンで目的の濃度となるように希釈する操作。

b)  DMSO

分配  ヘキサン飽和 DMSO を試料に添加し,かき混ぜによって PCB を DMSO に抽出・分配す

る操作。

c)

ヘキサン逆抽出  PCB を含む DMSO にヘキサン洗浄水及びヘキサンを添加し,かき混ぜによって PCB

をヘキサンに抽出・分配する操作。

d)

硫酸処理  PCB を含む溶液を発煙硫酸又は硫酸を含むシリカゲルなどに接触させて PCB 以外の不純

物を分解する操作。発煙硫酸を使用する場合にはガラス試験管を,硫酸シリカゲルを使用する場合に

はカラムを用いる。また,分解物と PCB との分離は,試験管からの分取又はカラムからの溶出によっ

て実施する。

e)

多層シリカゲルカラム処理  PCB を含む溶液を硫酸,硝酸銀などを含むシリカゲルを多層に充てんし

たカラムに供給し,PCB 以外の不純物を分解,除去する操作。


13

K 0464

:2009

なお,必要に応じてカラム内の反応温度を加熱などによって調節する。不純物と PCB との分離は,

カラムからの溶出にて実施する。

f)

DMSO

置換  PCB を含む分画溶液(ヘキサン溶液)に DMSO を添加し,加熱処理又は減圧処理,若

しくは室温下での窒素吹き付けによってヘキサンを除去し,PCB を DMSO に移行させる。又は,PCB

を含むヘキサン溶液をアルミナを充てんしたカラムに供給し,ヘキサンを乾燥によって除去した後,

DMSO によって PCB を溶出する。

上記の操作を組み合わせた前処理の例を,

図 A.1 に示す。

例 

例 

試料

試料

多層シリカゲルカラムによる加熱精製

ヘキサン添加後,DMSO 分配

アルミナカラムによる濃縮

ヘキサン逆抽出

アルミナカラムの乾燥による溶媒除去

発煙硫酸処理

ヘキサン揮発による DMSO への PCB の置換

加熱下,アルミナカラムからの DMSO
での PCB の溶出

例 3  

例 4  

試料

試料

DMSO 分配

発煙硫酸シリカゲルカラムによる精製

ヘキサン逆抽出

ヘキサン揮発による DMSO 分配

硝酸銀シリカゲルカラムによる精製

ヘキサン揮発による DMSO への PCB の置換

図 A.1−前処理例(例 14


14

K 0464

:2009

附属書 B

(参考)

フローチャート

B.1 PCB

検出のためのイムノアッセイの測定操作例 

フロー式免疫測定方法のフローチャート例を,

図 B.1 に示す。バッチ式免疫測定方法のフローチャート

例を,

図 B.2 に示す。

試料,又は標準物質と抗 PCB 抗体(蛍光標識)とを混合し,反応を行う 
(5∼60 分間)

反応液を抗原−キャリア結合体固定化固相(プラスチックビーズ)に通液する 
(通液流量:0.75 mL/min,通液量:0.5 mL)

抗原−キャリア結合体固定化固相上で未反応抗体を分離,捕そくする 

抗原−キャリア結合体固定化固相に緩衝液を通液し,非特異的結合物質を除去
する(通液流量:0.75 mL/min,通液量:0.75 mL)

抗原−キャリア結合体固定化固相に捕そくされた抗 PCB 抗体量(蛍光量)を
測定する

測定結果を計算する

抗原−キャリア結合体固定化固相に再生液を通液し,抗 PCB 抗体を除去する
(通液流量:0.75 mL/min,通液量:0.75 mL)

抗原−キャリア結合体固定化固相に緩衝液を通液し,固相を再生する 
(通液流量:0.75 mL/min,通液量:0.75 mL)

図 B.1−フロー式免疫測定方法のフローチャートの例


15

K 0464

:2009

試料又は標準物質と抗 PCB 抗体とを抗原−キャリア結合体固定化固相(マイ
クロプレート)に添加し,反応を行う

(100 μL,60 分間)

抗原−キャリア結合体固定化固相に結合しなかった成分を洗浄除去する 
(300 μL×3 回)

抗体トレーサー(酵素標識抗体)を加えて抗原−キャリア結合体固定化固相に
結合した抗 PCB 抗体と反応を行う(100 μL,60 分間)

抗原−キャリア結合体固定化固相に結合しなかった成分を洗浄除去する 
(300 μL×3 回)

基質溶液を添加し,反応を行う(100 μL,30 分)

反応停止液を添加する(100 μL)

吸光度を測定する

測定結果を計算する

図 B.2−バッチ式免疫測定方法(間接酵素免疫測定方法)のフローチャートの例


16

K 0464

:2009

附属書 C 
(参考)

免疫測定方法(イムノアッセイ)の分類

C.1 

免疫測定方法(イムノアッセイ)の分類 

免疫測定方法(イムノアッセイ)は通常,

図 C.1 のように分類する。

非標識法

標識法

免疫測定方法

均一法

不均一法

非競合法

競合法

非競合法

競合法

ホモジニアス)

(イムノアッセイ)

(ヘテロジニアス)

図 C.1−免疫測定方法(イムノアッセイ)の分類

C.2 

非標識法 

非標識法は,沈降性の抗原抗体結合物を濁度,光散乱,沈降線の有無などによって検出する方法である。

しかし,これらの方法は簡便ではあるが,多くの成分が共存している複雑な試料中で目的成分だけを高感

度に測定することはできない。

C.3 

標識法 

標識法は,標識された抗原抗体結合物又は標識体だけを測定する方法であり,均一(ホモジニアス)法

と不均一(ヘテロジニアス)法とがある。両者は,競合法と非競合法とに大別できる。

a)

均一法は,標識体と試料との抗原抗体反応の結果,標識シグナルの増減によって,抗原又は抗体を測

定する方法である。

b)

不均一法は,何らかの方法で,抗原抗体結合物(B)及び遊離体(F 抗原だけ,又は抗体だけ)を分離

後,B 又は F 画分の標識シグナルを検出することによって,非標識の抗原又は抗体を測定する方法で

ある。

イムノアッセイに用いる標識又は検出対象及びその検出法の例を,

表 C.1 に示す。


17

K 0464

:2009

表 C.1−イムノアッセイに用いる標識物質又は検出対象及びその検出法の例

イムノアッセイ

標識物質又は検出対象

検出法

I.  ラジオイムノアッセイ

ラジオアイソトープ  (

3

H,

14

C,

125

I)

放射能

II.  非放射性イムノアッセイ

a)

  標識体を用いる方法

酵素イムノアッセイ

酵素,補酵素,酵素活性標識物質

酵素活性

蛍光イムノアッセイ

蛍光物質

蛍光強度,蛍光偏光度など

発光イムノアッセイ

化学発光・生物発光物質

発光強度

磁性イムノアッセイ

磁性体

磁気特性

スピンイムノアッセイ

遊離ラジカル物質

電子スピン共鳴

メタロイムノアッセイ

金属原子,金属イオン,Eu

3

キレート

原子吸光,時間分解蛍光

粒子イムノアッセイ

金属コロイド粒子,ラテックス粒子

原子吸光,粒子数の計測,

光学特性

パイロイムノアッセイ

バクテリオファージ

溶菌数

b)

  標識しない方法

ネフェロイムノアッセイ

抗原抗体結合物による凝集物

光散乱

イムノセンサー

抗原抗体反応による電気信号

電気特性

PCB の免疫測定方法は通常,標識物質を用いた不均一法であり,その例を表 C.2 に示す。 

表 C.2PCB の免疫測定方法の例

測定方法

標識物質

検出法

I.  フロースルー形

蛍光物質

蛍光強度

金コロイド粒子

光学特性

II.  ラテラルフロー形

酵素

酵素活性

金コロイド粒子

光学特性

磁性粒子

磁気特性

III.  酵素イムノアッセイ

酵素

酵素活性

放射性同位元素を標識に用いる方法を放射性イムノアッセイというのに対して,それ以外の標識イムノ

アッセイを非放射性イムノアッセイという。これらの内で,酵素イムノアッセイは,酵素反応による増幅

効果と検出法との組合せで,高感度化できる場合がある。酵素イムノアッセイに用いる酵素及びその酵素

活性測定法の例を

表 C.3 に示す。


18

K 0464

:2009

表 C.3−酵素イムノアッセイに用いる酵素及びその酵素活性測定法の例

酵素

酵素活性測定用基質

測定法

3, 3', 5, 5'-テトラメチルベンチジン

吸光度法

o-

フェニレンジアミン

吸光度法

ABTS

吸光度法

3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸

蛍光光度法

ペルオキシダーゼ

ルミノール/過酸化水素

化学発光法

o-

ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド

吸光度法

β-D-ガラクトシダーゼ

4-メチルウンベリフェリル-β-D-ガラクトシド

蛍光光度法

p-

ニトロフェニルりん酸

吸光度法

4-メチルウンベリフェリルりん酸

蛍光光度法

アルカリ性フォスファターゼ

CSPD

化学発光法

りんご酸脱水素酵素

りんご酸/NAD

紫外吸光度法

グルコース-6-りん酸脱水素酵素

グルコース-6-りん酸/NAD

紫外吸光度法

注記  ABTS:2,2'-アジノ-ビス(3-エチル-ベンズチアゾリン)スルホン酸

CSPD:3-(4-メトキシスピロ{1,2-ジオキセタン-3,2'-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 1

3, 7

]デカ

ン}-4-イル)フェニルりん酸二ナトリウム 
NAD

:酸化形ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド

参考文献  [1] Blake II, R. C., A. R. Pavlov and D. A. Blake ; Automated kinetic exclusion assays to quantify

protein binding interactions in homogeneous solution, Analytical Biochemistry, 272 (1999)

123-134. 

[2]  大村直也,T. R. Glass,佐々木和裕,城孝司,見幸弘,今西克也,寺門真吾;イムノアッセイによ

る絶縁油中のポリ塩化ビフェニルのスクリーニング,分析化学,第 55 巻第 7 号 (2006) 519-523.

[3] Margit M., Tilmann R., Markus K.,Sven S., Franz L., Dieter M., Rainer Z., Andrew R. and Hugo A. ;

Quantitative Bedside Assay for Cardiac Troponin T:A Complementary Method to Centralized

Laboratory Testing, Clin. Chem.,45 (1999) 1002-1008.

[4] T. Ono, K. Sugiyama, T. Kuroda, M. Kawamura, S. Arao and H. Nariuchi ; A Quantitative

Immunochromatography Assay of Whole Blood Samples for Antigen-specific IgE−A New Method

for Point of Care Testing for Allergens, Allergology International, 54 (2005) 393-399.

[5] Y. Hayashi,R. Matsuda,T. Maitani,K. Ito,W. Nishimura,K. Imai and M. Maeda ; An expression

of within-plate uncertainty in sandwich ELISA.,J. Pharm. Biomed. Anal.,36 (2004) 225-229.

[6] Dudley R.A.,Edwards P.,Ekins R.P.,Finney D.J.,Mckenzie I.G.M.,Raab G.M.,Rodbard D. and

Rodgers R.P.C. ; Guidelines for immunoassay data processing., Clin. Chem.,31 (1995) 1264-1271.

[7] JIS C 2101  電気絶縁油試験方法

[8] JIS C 2320  電気絶縁油

[9] JIS K 3800  バイオハザード対策用クラス II キャビネット 
[10] JIS K 8550  硝酸銀(試薬)

[11] JIS K 8741  発煙硫酸(試薬)

[12] JIS K 8825  ヘキサン(残留農薬・PCB 試験用)(試薬) 
[13] JIS K 8951  硫酸(試薬)

[14] JIS R 3503  化学分析用ガラス器具

[15] JIS R 3505  ガラス製体積計