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K 0350-70-10

:2005

(1) 

まえがき

この規格は,工業標準化法第 12 条第 1 項の規定に基づき,社団法人日本工業用水協会(JIWA)/財団法人

日本規格協会(JSA)から,工業標準原案を具して日本工業規格を制定すべきとの申出があり,日本工業標準

調査会の審議を経て,経済産業大臣が制定した日本工業規格である。

この規格の一部が,技術的性質をもつ特許権,出願公開後の特許出願,実用新案権,又は出願公開後の

実用新案登録出願に抵触する可能性があることに注意を喚起する。経済産業大臣及び日本工業標準調査会

は,このような技術的性質をもつ特許権,出願公開後の特許出願,実用新案権,又は出願公開後の実用新

案登録出願にかかわる確認について,責任はもたない。

JIS K 0350-70-10

には,次に示す附属書がある。

附属書 1(参考)さや(鞘)の確認方法及び偽分岐の確認方法


K 0350-70-10

:2005

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目  次

ページ

1.

  適用範囲

1

2.

  引用規格

1

3.

  定義

1

4.

  共通事項

1

4.1

  ガラス器具類 

1

5.

  試料

1

5.1

  試料の採取 

1

5.2

試料の取扱い

2

6.

  試験方法

2

6.1

  器具及び装置 

2

6.2

  試料の前処理 

3

6.3

  操作

3

7.

  結果の表示 

3

附属書 1(参考)さや()の確認方法及び偽分岐の確認方法 

5

 


日本工業規格

JIS

 K

0350-70-10

:2005

工業用水中のスフェロチルス試験方法

Testing method for detection of Sphaerotilus in industrial water

1.

適用範囲  この規格は,工業用水中のスフェロチルスの存在を顕微鏡によって定性的に判定する試験

方法について規定する。

2.

引用規格  付表 に示す規格は,この規格に引用されることによって,この規格の規定の一部を構成

する。これらの引用規格は,その最新版(追補を含む。

)を適用する。

3.

定義  この規格で用いる主な用語の定義は,JIS K 0101JIS K 0102JIS K 0550 及び JIS K 0211 

よるほか,次による。

3.1

スフェロチルス  透明なさや(鞘)の中に 1×(2.0∼6.0)

µm の円筒状のかん(桿)菌が一列に並んだ糸状

体を形成し,灰白色の綿状集落(ミズワタ)を形成する細菌。

備考  スフェロチルスは,生活排水,工場廃水などの有機物の多い水中でよく生育する代表的な汚濁

指標細菌の一つである。

スフェロチルス  ナタンス(Sphaerotilus natans)が代表的なものとして知られている。

スフェロチルスは,通常,ミズワタと呼ばれるもので,工業用水中でスライム及びフロック

を形成することが多く,繁殖すると,浄水過程におけるろ過障害,異臭の発生などの水質の悪

化,給配水,冷却水系統などの閉そく(塞),熱交換器の効率低下など,多様な障害の原因とな

る。

4.

共通事項  共通事項は,次による。

4.1

ガラス器具類  ガラス器具類は,一般に JIS R 3503 及び JIS R 3505 に規定するものを使用する。た

だし,特殊な器具を必要とする場合には,それぞれの項目に,その一例を図示又は説明する。

5.

試料

5.1 

試料の採取

5.1.1

試薬  試薬は,次による。

a) 

ホルムアルデヒド液  JIS K 8872 に規定するホルムアルデヒド液[37  %(質量分率)](

1

)(

2

)

を用いる。

(

1

ホルムアルデヒド液の取扱いについては,関係法令などに従い,十分に注意する。

(

2

ホルムアルデヒド液に代えて 1,5-ペンタンジアール(グルタルアルデヒド)液[25  %(質量分率)]

を用いてもよい。

5.1.2

器具  器具は,次による。

a) 

試料容器  共栓ガラス瓶又は清浄なポリエチレン製瓶 100∼1 000 ml。

b) 

採水器  ハイロート採水器。図  1 に一例を示す。


2

K 0350-70-10

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                                                                  A:ガラス瓶(100∼1 000ml)

                                                                  B:栓

                                                                  C:鎖

                                                                  D:開栓用鎖

                                                                  E:瓶の保持板の止め金具用鎖

                                                                  F:瓶の保持板

                                                                  G:携帯箱

                                                                  H:携帯箱のふた

                                                                  I:おもり

  1  ハイロート採水器及び携帯箱の一例

5.1.3

操作  試料の採取は,次による。

a) 

表層水の採取  湖沼,河川,水路,貯水槽などの表層水で,直接採取できる場合は,試料容器で試料

を採取する。直接採取できない場合は,採水器を用いて採取する。

b) 

各深度の水の採取  一定の深さの水は,採水器を用いて採取する(

3

)

(

3

ハイロート採水器による採取が困難な場合には,バンドーン採水器を用いて採取し,試料容器

に移す。

c) 

給水栓からの採取  栓を開き,配管中の水を十分に放出した後,試料容器に採取する。

d) 

配管,装置からの採取  c)と同様に操作して採取する。

5.2 

試料の取扱い  試験は試料採取後,直ちに行う。直ちに試験ができない場合には,試料 100 ml につ

きホルムアルデヒド液 3 ml[3  %(体積分率)](

4

)

を添加し,0∼5  ℃(凍結させない。)の暗所に保存する。

(

4

)  1

,5-ペンタンジアール(グルタルアルデヒド)液[25  %(質量分率)]を用いる場合は,試料 100 ml

につき 4 ml[4  %(体積分率)]を添加する。

6. 

試験方法

6.1 

器具及び装置  器具及び装置は,次による。

a)

マイクロピペット  0.05∼0.1 ml。

b)

駒込ピペット  1∼10 ml。

c)

スライドガラス  JIS R 3703 に規定するもの。大きさは,76×26 mm のもの。

d)

カバーガラス  JIS R 3702 に規定するもの。大きさは,18×18 mm,24×24 mm 又は 32×24 mm のも

の。

e)

顕微鏡及びその附属品  顕微鏡は,総合倍率 20∼600  倍が得られるもので,次のものからなる。

1)

顕微鏡  JIS B 7132 に規定する生物顕微鏡(

5

)

2)

対物レンズ  呼び倍率 4,10,20 及び 40 のもの。

3)

接眼レンズ  呼び倍率 5∼15  のもの。

4)

十字標本移動器(メカニカルステージ)  顕微鏡に取り付け,スライドガラスを前後左右に移動でき

るもの。


3

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(

5

位相差装置又は微分干渉装置が附属していると便利である。

f)

遠心管  1 ml ごとに標線が入った,ねじぶた付きのガラス製の容量 10∼50 ml のもの。市販の滅菌済

みのポリエチレン製のものを用いてもよい。

g)

遠心機  JIS T 1701 に規定するもの。遠心力 15 000∼30 000 m/s

2

{

約 1 500∼3 000 g}で制御できるもの。

6.2 

試料の前処理  スフェロチルスが少なく,濃縮が必要とされる場合は,次による。

a)

よく振り混ぜて均一にした 5.の試料の適量を,遠沈管にとり,

遠心機を用いて,

遠心力(

6

)15 000

∼30 000

m/s

2

{

約 1 500∼3 000 g}で 20 分間(

6

)

遠心分離する。遠心分離を停止する際には,沈殿物を巻き上げな

いようにするため,自然停止させる。

(

6

ここで示した遠心分離条件は目安であり,試験対象生物の変形,破壊がない条件を予備試験な

どで調べておく。

b)

沈殿物を巻き上げないように注意して上澄み液を駒込ピペットなどで吸引除去し,沈殿物を含めて残

りの体積をもとの体積の

10

1

~

2

1

  (

7

)

にする。

(

7

)

スフェロチルスの存在量に応じて,適宜,選択する。スフェロチルスが少ない場合は,一度濃

縮した試料を集め,再度,遠心分離して濃縮するとよい。

c)

6.3

の操作を行う直前に,沈殿物が均一になるようによく振り混ぜる。

6.3 

操作  操作は,次による。

a)

よく振り混ぜて均一にした 5.の試料又は 6.2 で得た試料 0.05∼0.1 ml をスライドガラスにとり,カバ

ーガラスを載せ(

8

)

,顕微鏡を用いて,20∼600  倍で観察する。

(

8

カバーガラスから試料がはみ出さないようにカバーガラスの大きさを,適宜,選択するととも

に,カバーガラスを載せる場合に,試料がはみ出さないように注意する。

b)

各視野に出現する生物のうち,生物図鑑などの資料を参考にして,透明なさや(鞘)をもった偽分岐の

ある糸状体細菌でスフェロチルスと判断される形態をもつ生物の有無を確認する(

9

)(

10

)

(

9

)

視野を移動しながら,スフェロチルスの存在の有無を確認する。スフェロチルスの数が多い場

合は,10∼20 視野について検鏡し,少ない場合はカバーガラスの全面を検鏡する。

(

10

スフェロチルスの存在が確認できたら,顕微鏡写真を撮影しておくことが望ましい。

参考1.  さや(鞘)の確認方法及び偽分岐の確認方法は,附属書 によるとよい。

2. 

生物図鑑などの資料には,次のようなものがある。

下水試験方法(社団法人日本下水道協会)(1997 年版)

上水試験方法(社団法人日本水道協会)(2001 年版)

日本の水道生物−写真と解説−(社団法人日本水道協会)(1993)

環境微生物図鑑(株式会社講談社)(1995)

Standard Methods for The Examination of Water and Wastewater (APHA

,AWWA,WEF)(20th

Ed.

,)(1998)

Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology(Williams&Wilkins)(1989)

7. 

結果の表示  結果には,試料の採取場所,採取日時,試験日時,スフェロチルスの存在の有無,参考

として用いた図鑑名などを付記する。写真撮影を行った場合は,併せて添付する。


4

K 0350-70-10

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付表  1  引用規格

JIS B 7132

  生物顕微鏡

JIS K 0101

  工業用水試験方法

JIS K 0102

  工場排水試験方法

JIS K 0211

  分析化学用語(基礎部門)

JIS K 0550

  超純水中の細菌数試験方法

JIS K 8872

  ホルムアルデヒド液(試薬)

JIS R 3503

  化学分析用ガラス器具

JIS R 3505

  ガラス製体積計

JIS R 3702

  顕微鏡用カバーガラス

JIS R 3703

  顕微鏡用スライドガラス

JIS T 1701

  医療用遠心機

関連規格  K 0557  用水・排水の試験に用いる水

K 8102

  エタノール(95)(試薬)

K 8294

  クリスタルバイオレット(試薬)

K 8521

  しゅう酸アンモニウム−水和物(試薬)

K 8804

  塩基性フクシン(試薬)

K 8983

  硫酸銅(Ⅱ)5和水物(試薬)


5

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附属書 1(参考)さや(鞘)の確認方法及び偽分岐の確認方法

序文  この附属書は,本体 6.3 において確認されたさや(鞘)及び偽分岐の確認方法を示したものであり,規

定の一部ではない。

1.

さや()の確認方法  さや(鞘)の確認方法には,Hiss 法及びクリスタルバイオレット法を適用する。

1.1

Hiss

法  本体 6.3 において確認された透明なさや(鞘)をもった偽分岐のある糸状体細菌を,フクシン

染色液を用いて染色した後,硫酸銅(Ⅱ)溶液で洗浄し,検鏡する。このとき,さや(鞘)は薄赤,菌体は赤く

染まる。

参考文献  微生物学実習提要  東京大学医科学研究所学友会編(丸善株式会社)(1998 年発行  第二版)

a)

試薬  試薬は,次による。

1)

水  JIS K 0557 に規定する A2 又は A3(

1

)

の水。

(

1

石英ガラス又はほうけい酸ガラス-1 製の蒸留器で精製したもの。

2)

フクシン染色液  JIS K 8804 に規定する塩基性フクシン約 7 g を JIS K 8102 に規定するエタノール

(95)100 ml

に溶かす。このエタノール溶液 5 ml を水 65∼95 ml に溶かし,よく振り混ぜる。

3)

硫酸銅()溶液  JIS K 8983 に規定する硫酸銅(Ⅱ)五水和物 20 g を水に溶かして 100 ml とする。

b)

器具及び装置  器具及び装置は,次による。

1)

スライドガラス  本体 6.1 c)による。

2)

カバーガラス  本体 6.1 d)による。

3)

顕微鏡及びその附属品  本体 6.1 e)による。

c)

操作  操作は,次による。

1)

清浄なカバーガラスに水を白金耳でとり,更にこのカバーガラスに本体 6.3 b)で得られた透明なさ

や(鞘)をもった偽分岐のある糸状性細菌を白金線でとる。カバーガラス上の水とよく混ぜながら薄

く均一に塗り広げ,自然乾燥する。菌体をとる量は,乾いたときに塗抹した部分がわずかに曇る程

度がよい。

2)

塗抹面を上にして火炎の中をややゆっくりと 3 回連続して通過させる。

3)

フクシン染色液を試料を覆うように滴加し,この染色液から蒸気が生じるまで 1∼2 分間弱く加熱し

て染色する。このとき,沸騰させないように注意する。

4)

硫酸銅(Ⅱ)溶液で洗い,水洗いせずにそのまま乾燥するか又はぬれたまま塗抹面を下にしてスライ

ドガラスに載せ,検鏡する。

1.2

クリスタルバイオレット法  本体 6.3 において確認された透明なさや(鞘)をもった偽分岐のある糸状

体細菌を,クリスタルバイオレット溶液で染色する。このときさや(鞘)は薄青,菌体は青く染まる。

a)

試薬  試薬は,次による。

1)

クリスタルバイオレット溶液  JIS K 8294 に規定するクリスタルバイオレット約 11 g を乳鉢で細か

くすりつぶし,その 10 g をとり,JIS K 8102 に規定するエタノール(95)100 ml を少量ずつ加えて溶

かした後,ろ紙 5 種 B でろ過する。この溶液 20 ml としゅう酸アンモニウム溶液(JIS K 8521 に規定

するしゅう酸アンモニウム一水和物 0.8 g を水 80 ml に溶かす。)80 ml とを混合する。この溶液は,

褐色瓶に入れて保存する。

参考  市販されているグラム染色液(

Hucker

の変法 A 液)を使用してもよい。


6

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b)

器具及び装置  器具及び装置は,次による。

1)

スライドガラス  本体 6.1 c)による。

2)

カバーガラス  本体 6.1 d)による。

3)

顕微鏡及びその附属品  本体 6.1 e)による。

c) 

操作  操作は,次による。

1)

清浄なカバーガラスに水を白金耳でとり,更に,このカバーガラスに本体 6.3 b)で得られた透明な

さや(鞘)をもった偽分岐のある糸状性細菌を白金線でとる。カバーガラス上の水とよく混ぜながら

薄く均一に塗り広げ,自然乾燥する。このとき塗抹面がかなり薄い白に見える程度にする。次に,

塗抹面を上にして弱い火炎中をゆっくり 3  回通して固定する(

2

)

2)

クリスタルバイオレット溶液を塗抹面の全体に滴加し,カバーガラスをゆっくり動かしながら約 1

分間染色する。染色後,塗抹面を下にしたカバーガラスに,水道水又は洗浄瓶を用い,ごく弱い流

水を静かにそそぎ,色素をよく洗い流す。風乾後,塗抹面を下にして,スライドガラスに載せ,検

鏡する。

(

2

)

固定が不完全であると,塗抹した菌体が水洗操作中にはく離してしまう。

2.

偽分岐の確認方法  偽分岐とは,さや(鞘)の中の細胞が枝分かれしてるのではなく,細胞の入ったさ

やに別の細胞が入ったさやが付着して外見上,枝分かれしているように見える状態をいい,400∼600  倍で

検鏡して確認する。位相差法又は微分干渉法を用いるとよい。

                        (拡大図)

附属書図  1  スフェロチルス  ナタンス

[

下水試験方法(社団法人日本下水道協会)(1997 年版)の図 1-30(1),1 に加筆]