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K 0350-20-10 : 2001

(1) 

まえがき

この規格は,工業標準化法第 12 条第 1 項の規定に基づき,社団法人日本工業用水協会 (JIWA) /財団法

人日本規格協会 (JSA) から工業標準原案を具して日本工業規格を制定すべきとの申出があり,日本工業標

準調査会の審議を経て,経済産業大臣が制定した日本工業規格である。


K 0350-20-10 : 2001

(1) 

目次

ページ

1.

  適用範囲

1

2.

  引用規格

1

3.

  共通事項

1

4.

  試料

2

4.1

  試料の採取及び細菌の捕集

2

4.2

  試料及び細菌の取扱い

4

5.

  結果の表示

4

6.

  大腸菌群数の試験

4

6.1

  平板培地による試験

4

6.2

  液体培地による試験(最確数試験)

6

6.3

  推定試験及び確定試験

9

7.

  ふん便性大腸菌群の試験

11

付表 1  引用規格 13


日本工業規格

JIS

 K

0350-20-10

: 2001

用水・排水中の

大腸菌群試験方法

Testing methods for detection and enumeration of

coliform organisms in industrial water and waste water

1.

適用範囲  この規格は,工業用水,工場排水中などの大腸菌群の試験方法について規定する。

2.

引用規格  付表 に示す規格は,この規格に引用されることによって,この規格の規定の一部を構成

する。これらの引用規格は,その最新版(追補を含む。

)を適用する。

3.

共通事項

3.1

通則  化学分析に共通する一般事項は,JIS K 0050 による。

3.2

定義  この規格で用いる主な用語の定義は JIS K 0101JIS K 0102JIS K 0550 及び JIS K 0211 によ

るほか,次による。

a)

大腸菌群  グラム染色陰性,無芽胞のかん(桿)菌で,ラクトースを分解して酸と気体を生成する好

気性又は通性嫌気性の菌。

3.3

水  この規格で用いる水は,JIS K 0557 に規定する A2 又は A3(

1

)

の水。

(

1

)

石英ガラス又はほうけい酸ガラス−1製の蒸留器で精製したもの。

3.4

試薬  試薬は,次による。

a)

試薬は,品目指定されている場合には,JIS に規定されているものの最上級の品質のものを用い,JIS

に規定されているものがない場合には,試験に支障のないものを用いる。

b)

試薬類の溶液の濃度は,一般に,質量濃度は g/L 又は mg/L,モル濃度は mol/L 又は m mol/L で示す。

なお,化合物については,無水物としての質量を用いる。

c)

試薬類の溶液名称の後に括弧で示されている濃度は,標準液以外は概略の濃度であることを意味する。

例えば,水酸化ナトリウム溶液 (1mol/L) は約 1mol/L の水酸化ナトリウム溶液であることを示す。

d)

液体試薬の濃度は,水(又は別の液体試験)との混合比[試薬 (a+b)]で表す。この表し方は,試薬

aml

と水(又は別の液体試薬)bml とを混合したことを示す。

なお,JIS K 0050 

表 の液体試薬(例えば,塩酸など)を薄めないで用いる場合は,その試薬名

だけで示す。

e)

試薬類の調製に用いる水は 3.3 の水による。

f)

試薬類及び廃液などの取扱いについては,関係法令などに従い十分に注意する。

参考  試薬類の名称は,国際純正及び応用化学連合  (IUPAC)  の無機化学命名法及び有機化学命名法

を基にして,社団法人日本化学会が定めた化合物命名法及び JIS 試薬の名称とできるだけ整合


2

K 0350-20-10 : 2001

を図った。

3.5

器具などの滅菌操作  器具などの滅菌操作は,次による。

a)

乾熱滅菌  ガラス製及び金属製器具類の滅菌に用いる。約 170℃で約 1 時間滅菌する。

b)

高圧蒸気滅菌  培地,希釈水,採水瓶,使用済み培地などの滅菌に用いる。121℃で 15∼20 分間滅菌

する。

c)

火炎滅菌  試験管及びフラスコの口部などの滅菌に用いる。試験管及びフラスコは,培養操作の前後

に斜めに持って回しながら口部を火炎の中にしばらく入れて滅菌する。

3.6

消毒操作  消毒操作は,次による。

a)

試験操作の前後には,手指及び実験台を消毒する。手指の消毒にはクレゾール石けん溶液 (10g/L),

陽性石けん溶液 (1∼10g/L),消毒用エタノール(日本薬局方に規定するもの)又はエタノール (80vol%)

JIS K 8102 に規定するエタノール (95) を用いて調製する。

]を用いる。

実験台は,陽性石けん溶液 (10g/L) ,消毒用エタノール又はエタノール (80vol%) などを噴霧する

か,これらを含ませた布でぬぐって消毒する。

b)

使用済みのピペット,採水瓶,採水器などの器具は,クレゾール石けん溶液 (30∼50g/L)  などの消毒

液中に 1 日間浸した後(又は高圧蒸気滅菌した後)

,消毒液が完全に除去されるまで,

水でよくすすぐ。

c)

培養試験後の試験管,ペトリ皿類は,培地ごと 3.5b)

の高圧蒸気滅菌を行った後,培地を捨ててからよ

く水洗する。

3.7

ガラス器具類  ガラス器具類は,JIS R 3503 及び JIS R 3505 に規定するものを使用する。ただし,

特殊な器具を必要とする場合には,それぞれの項目に,その一例を図示又は説明する。

また,加熱操作を伴う場合には,JIS R 3503 に規定するほうけい酸ガラス−1 を用いる。

4.

試料

4.1

試料の採取及び細菌の捕集  試料中の大腸菌群が多いと予想される場合には,採水瓶又は採水器を

用いて試料を採取する。また,試料中の大腸菌群が少ないと予想される場合には,試料の一定量を孔径

0.45

µm のメンブレンフィルターでろ過し,大腸菌群をメンブレンフィルターに捕集する。

a)

器具  器具は,次による。

1)

採水瓶  共栓ガラス瓶 100ml  採水瓶(

2

)

は,栓部と首部をアルミニウムはく(又は硫酸紙)などで

覆って 3.5a)

の乾熱滅菌又は 3.5b)の高圧蒸気滅菌を行う。又は滅菌済みの細菌試験用のポリエチレ

ン瓶を用いてもよい。試料採取時まで汚染を受けないように注意する。

(

2

)

残留塩素などの酸化性物質を含む試料を採取する場合には,採水瓶に JIS K 8637に規定するチ

オ硫酸ナトリウム五水和物(粉末にしたもの。

)20∼30mg を入れ,3.5b)の高圧蒸気滅菌又はオ

キシラン(エチレンオキシド)滅菌をしておく。

2)

採水器  図 に一例を示す。ハイロート採水器  採水器は携帯箱に収めて 3.5a)の乾熱滅菌を行う(

3

)

(

3

)

採水器に,1)の滅菌済みの採水瓶を用いる場合には,採水瓶の滅菌は省略してもよい。


3

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図 1  採水器の一例

3)

ろ過器(分離形)  図 に一例を示す。ろ過器の各部をアルミニウムはく(又は硫酸紙など)に包

んで,材質に適した滅菌をしておく。

図 2  ろ過器(分離形)の一例

4)

メンブレンフィルター  孔径 0.45

µm,直径約 50mm のもの。アルミニウムはく(又は硫酸紙など)

に包み,ガラス製ペトリ皿に入れて 3.5b)の高圧蒸気滅菌を行う。又は滅菌済みの市販品を用いても

よい。メンブレンフィルターの取扱いには,ピンセットを用いる。

5)

ピンセット  先端が平らで滑らかなもの。使用直前に 3.5c)の火炎滅菌を行う。

b)

操作  試料の採取及び細菌の捕集は,次による。

1)

試料中の大腸菌群が多いと予想される場合には,採水瓶に採取する。

1.1)

表層水の採取  河川,水路などの表層水は,採水瓶に直接採取する。

1.2)

各深度の水の採取  一定の深さの水は,ハイロート採水器を用いて採取する。

1.3)

給水栓からの採取  あらかじめ,3.5c)の火炎滅菌に準じて給水栓口を滅菌した後,栓を開き,配


4

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管中の水を十分に放出した後,採水瓶に採取する。

1.4)

配管,装置からの採取  1.3)と同様に操作して採取する。

2)

試料中の大腸菌群が少ないと予想される場合には,試料の一定量(

4

)

をメンブレンフィルターでろ過

し,捕集する。

2.1)

工程水など,大腸菌群が少ないと予想される配管,装置から大腸菌群を捕集する場合には,JIS K 

0550

の 3.3 の操作に従って大腸菌群を直接メンブレンフィルターに捕集する(

4

)

2.2) 2.1)

の操作ができない場合には,1.4)の操作を行ってあらかじめ滅菌した試料容器(ガラス又はポ

リエチレン製)1∼2L に試料を採取し,ろ過器(分離形)にメンブレンフィルターを取り付け,

吸引ろ過して大腸菌群を捕集する(

4

)

2.3)

試料が容器に入っている場合は,試料を十分に振り混ぜた後,2.2)と同様にろ過器(分離形)で吸

引ろ過して大腸菌群を捕集する(

4

)

(

4

)

培養後の集落数は20∼200個になるようにする。

4.2

試料及び細菌の取扱い  試験は試料採取後,直ちに行う。直ちに試験ができない場合には,0∼5℃

の暗所に保存し,9 時間以内に試験する。

5.

結果の表示  試験方法を付記し,試料 1ml 中の個数(又は 100ml 中の個数)で表示する。

6.

大腸菌群数の試験  大腸菌群数の試験は,平板培地による試験と液体培地による試験(最確数試験)

とに区分する。

6.1

平板培地による試験  デオキシコール酸塩寒天培地を用いて,36±1℃で 18∼20 時間培養し,培地

上に形成された赤い色の集落数を計数し,試料 1ml 中の個数で表す。

6.1.1

試薬及び培地  試薬及び培地は,次による。

a)

水  3.3 による。

b)

希釈水  生理食塩水(JIS K 8150 に規定する塩化ナトリウム 8.5g を水に溶かして 1L とする。)又はり

ん酸塩緩衝液 (pH 7.2) [JIS K 9007 に規定するりん酸二水素カリウム 34g を水約 500ml に溶かし,こ

れに水酸化ナトリウム溶液 (1mol/L) (JIS K 8576 に規定する水酸化ナトリウムを用いて調製する。

を滴加して pH を 7.2 に調節し,JIS K 0557 に規定する炭酸を含まない水を加えて全量を 1L とする。

を用いる。3.5b)の高圧蒸気滅菌を約 15 分間行う。

c)

デオキシコール酸塩寒天培地(

5

)

  ペプトン(カゼインのパンクレアチン水解物のペプトンを用いる。

10g, JIS K 8728

に規定するラクトース一水和物 10g, JIS K 8263 に規定する寒天(粉末)15g, JIS K 8150

に規定する塩化ナトリウム 5g,くえん酸アンモニウム鉄 (III) 2g 及び JIS K 9017 に規定するりん酸水

素二カリウム 2g を水 1L に加え,これを加熱(

6

)

して溶かし,ろ過した後,ろ液の pH を 7.4±0.1 に調

(

7

)

する。次に,この溶液にデオキシコール酸ナトリウム 1g 及びニュートラルレッド 33mg を加え,

再び pH を 7.4±0.1 に調節(

7

)

する。

d)

デオキシコール酸塩液体培地(

5

)

  c)のデオキシコール酸塩寒天培地を調製する際に寒天の添加を省略

して調製する。

(

5

)

市販の粉末培地を用いて調製してもよい。

(

6

)

長時間加熱すると変質することがある。

(

7

)

水酸化ナトリウム溶液 (1mol/L) 又は塩酸 (1mol/L) (JIS K 8180 に規定する塩酸を用いて調製

する。

)を用いて調節する。


5

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備考  培地は,水分の蒸発を防いで冷暗所に保存する。長期間経過したものは用いない。使用前に培

養器に入れ,36±1℃で約 18 時間培養して雑菌が混入していないことを確認する。

6.1.2

器具及び装置  器具及び装置は,次による。

a)

メスピペット  1ml  アルミニウムはく(又は硫酸紙)などに包むか,ピペット滅菌箱に先端を先に

して入れ,3.5a)の乾熱滅菌をしておく。

b)

希釈瓶  使用水量の 2 倍以上の容量の共栓ガラス瓶又は綿栓した試験管,若しくは三角フラスコ。い

ずれの場合も,3.5a)の乾熱滅菌をしておく。9ml 又は 99ml の目盛を付けておくと,希釈水を入れる場

合に便利である。

c)

ペトリ皿  ガラス製の直径約 90mm,高さ約 15mm のもの。アルミニウムはく(又は硫酸紙)などに

包んで,ペトリ皿滅菌箱に入れて 3.5a)の乾熱滅菌をしておく。又は JIS K 0950 に規定するプラスチ

ック製滅菌シャーレ 90B。

d)

吸収パッド  メンブレンフィルターと同じ直径の円形の厚形ろ紙で,液体培地約 2ml を含むことがで

きるもの。メンブレンフィルターと同様に滅菌する。滅菌済みの市販品を用いてもよい。

e)

三角フラスコ  300∼500ml 及び 1 000∼2 000ml 培地及び希釈水の調製に用いる。綿栓をして 3.5a)

乾熱滅菌又は 3.5b)の高圧蒸気滅菌をしておく。

f)

綿栓  脱脂をしていない繊維の長い良質の木綿わたを,試験管類及びフラスコ類の栓として用いる。

又は合成樹脂製,金属製及びシリコーン製の栓を用いてもよい。使用する前に 3.5a)の乾熱滅菌をして

おく。

g)

集落計数器  1.5∼2 倍の拡大鏡を備えたもの。

h)

培養器(ふ卵器)  JIS T 1702 に規定するふ卵器  36±1℃に調節できるもの。

i)

乾熱滅菌器  160∼200℃に調節できるもの。

j)

高圧蒸気滅菌器  JIS T 7322 又は JIS T 7324 に規定するもので,121℃以上に加熱でき,器内圧力

198kPa

で使用できるもの。

6.1.3

器具などの滅菌操作  器具などの滅菌操作は,3.5a)3.5c)による。

6.1.4

消毒操作  消毒操作は,3.6a)3.6c)による。

6.1.5

試料の希釈  試料の希釈は,次による。

a)

試料中の大腸菌群数が,試料 1ml 中に 200 個以上あると予想される場合には,試料(

8

)

を十分に振り混

ぜて均一にした後,その 1ml をメスピペット 1ml でとり,希釈水 9ml 又は 99ml を入れた希釈瓶に加

えてよく振り混ぜる。

b)

その 1ml をメスピペット 1ml でとり,a)と同じ操作で数段階の希釈試料を調製し,大腸菌群数が培養

後,20∼200 個の範囲で集落が得られる希釈試料を調製する。

なお,メスピペットは,その都度,滅菌済みのものを用いる。

(

8

)

試料が酸性,又はアルカリ性の場合には,水酸化ナトリウム溶液 (1mol/L) 又は塩酸 (1mol/L)

を用いて pH を7±0.2に調節する。

6.1.6

操作  操作は,次のとおり行う。

a)

4.1b)

によって採取した試料(

8

)

又は 6.1.5 で調製した希釈試料 1ml ずつをメスピペット 1ml を用いてそ

れぞれ 2 個以上のペトリ皿にとる(

9

)

b)

デオキシコール酸塩寒天培地を約 70℃の水浴中で加熱して解かした後,約 50℃に保ち,その約 15ml

を無菌的にそれぞれのペトリ皿に加え,固まらないうちに,緩やかに回しながら揺り動かしてよく混

ぜ合わせる(

10

)


6

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c)

ペトリ皿全体に培地と試料との混合物が広がったら,水平の状態で放置する。

d)

放冷後,更にデオキシコール酸塩寒天培地 5∼10ml を加えて重層し,凝固させる。

e)

ペトリ皿にふたをし,逆さにして培養器に入れ,36±1℃で 18∼20 時間培養する。

f)

集落計数器を用いて培地に生成した赤∼深紅色を呈する定形的集落数(円形状又は米粒状)(

11

)

を計数

し,平均値を求めて試料 1ml 中の個数(個/ml)で示す。希釈試料の場合には,集落数が 20∼200 個

程度得られるものを取り出し,試料 1ml 中の個数を求める。

(

9

)

試料中の大腸菌群数が少ないと予想される場合には,

備考3.によって操作する。

(

10

)

希釈試料を用いる場合には,希釈後,20 分間以内に培地との混合を行う。

(

11

)

疑わしい集落については,

それぞれを白金耳でとり,

6.3.2

の確定試験を行って確認するとよい。

備考1.  細菌培養後の使用済みの培地は,必ずペトリ皿のまま,3.5b)の高圧蒸気滅菌を行ってから廃

棄する。

2.

大腸菌群がふん便性であるか,又は非ふん便性であるかを類別するには,7.1b)の EC 液体培

地又は 7.1c)の M-FC 寒天培地を用いて試験するとよい。

3.

試料中の大腸菌群数が少ないと予想され,メンブレンフィルターで捕集した場合の操作は,

次による。

a)

ピンセットを用いて吸収パッドを 1 枚ずつ小形のペトリ皿(内径約 60mm)に入れ,吸収

パッドが,デオキシコール酸塩液体培地で十分に潤うようにデオキシコール酸塩液体培地

を加える(通常 2ml 程度でよい。

b)  4.1b)2)

の操作を行ったろ過器から,ピンセットを用いてメンブレンフィルターを取り外し

て a)の小形のペトリ皿の吸収パッド上に,ろ過面を上に密着させる。この際,メンブレン

フィルターと吸収パッドとの間に気泡が残らないように注意する。

c)

ペトリ皿にふたをし,逆さにして培養器に入れ,36±1℃で 18∼20 時間培養する。

d)

培地に生成した赤∼深紅色を呈する定形的集落数(円形状又は米粒状)(

11

)

を計数し,平均

値を求めて試料 100ml 中の個数(個/100ml)で示す。

6.2

液体培地による試験(最確数試験)  ブリリアントグリーン−ラクトース−胆汁−ブロス培地(BGLB

培地)を用いて,36±1℃で 48±3 時間培養し,最確数法によって大腸菌群数を求める。

6.2.1

試薬及び培地  試薬及び培地は,次による。

a)

水  3.3 による。

b)

希釈水  6.1.1b)による。

c)

ブリリアントグリーン−ラクトース−胆汁−ブロス培地(BGLB 培地)(

5

)

  ペプトン(カゼインのパ

ンクレアチン水解物を用いる。

)10g,  JIS K 8728 に規定するラクトース一水和物 10g を水 500ml に溶

かし,別に,乾燥した牛胆汁(粉末)20g を水約 200ml に溶かしたものを加え,更に水を加えて約 970ml

とし,滅菌後の pH が 7.0±0.1 になるように調節(

7

)

する。次に,ブリリアントグリーン溶液 (1g/L)

(

12

)13.3ml

及び水を加えて 1L とし,脱脂綿などでろ過して 6.2.2d)のダーラム発酵管(中試験管)に 10ml

ずつ移し入れ,3.5b)の高圧蒸気滅菌を約 15 分間行って手早く冷水中に浸して冷却した後,冷暗所に

保存する。ダーラム管内に気泡が残留しているものは使用しない。

(

12

)

ブリリアントグリーン0.10g を水に溶かして100ml とする。

備考  6.1.1 の備考による。ただし,培養時間は約 48 時間とする。

6.2.2

器具及び装置  器具及び装置は,次による。

a)

メスピペット  1ml 又は 10ml  アルミニウムはく(又は硫酸紙)などに包むか,ピペット滅菌箱に先


7

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端を先にして入れ,3.5a)の乾熱滅菌をしておく。

b)

希釈瓶  6.1.2b)による。

c)

試験管  中試験管 (18×165mm)  又は大試験管 (30×200mm)  。

なお,中試験管には 10ml 及び 20ml の標線,大試験管には 25ml 及び 75ml の標線を付けておくとよ

い。

d)

ダーラム発酵管  中試験管又は大試験管にダーラム管[ガラス管(外形約 8mm,高さ 30∼50mm)の

一端を封じたもの。

]の管口を下にして入れ,綿栓又はキャップをしたもの。

e)

三角フラスコ  6.1.2e)による。

f)

綿栓  6.1.2f)による。

g)

培養器(ふ卵器)  6.1.2h)による。

h)

乾熱滅菌器  6.1.2i)による。

i)

高圧蒸気滅菌器  6.1.2j)による。

6.2.3

器具などの滅菌操作  器具などの滅菌操作は,3.5a)3.5c)による。

6.2.4

消毒操作  消毒操作は,3.6a)3.6c)による。

6.2.5

操作  操作は,次のとおり行う。

a)

試料(

8

)10ml, 1ml, 0.1ml(

13

), 0.01ml(

13

)

のように連続した 4 段階の試料(

14

)

それぞれ 5 本ずつ(5-5-5 法)

をブリリアントグリーン−ラクトース−胆汁−ブロス培地を入れたダーラム発酵管(中試験管)に加

える。

b)

これを培養器に入れ,36±1℃で 48±3 時間培養する。

c)

気体の発生が認められたものは大腸菌群陽性管とし,各段階での陽性管の数(

15

)

を求める。

d)

これから最確数表(

表 1)を用いて試料 100ml 中の最確数(

16

)

を求める。

(

13

)

試料の量が0.1ml の場合は,希釈水で10倍に薄めた試料1ml を,また,試料の量が0.01ml の場合

は,希釈水で100倍に薄めた試料1ml を用いる。

(

14

)

試料は,その最大量を培養したものの全部か又は大多数が大腸菌群陽性となるように,また,

最少量を培養したものの全部か又は大多数が大腸菌群陰性となるように適切に薄めて用いる。

(

15

)

陽性管の組合せが,

表 の陽性管の組合せの中に該当しない場合は,操作手順などの誤りによ

るものであるので,操作の見直しが必要である。

(

16

)

表 の最確数表は薄めない試料 10ml, 1ml, 0.1ml ずつを培養したときの試料 100ml 当たりの最確

数を示したものであるので,試料を希釈した場合には,その補正が必要になる。

備考  6.1.6 の備考 1.による。


8

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表 1  大腸菌群試験の最確数表(5-5-5 法,10ml, 1.0ml, 0.1ml

陽性管の組合せ

10, 1, 0.1 (ml)

最確数

100ml

95%

信頼限界

下限    上限

陽性管の組合せ

10, 1, 0.1 (ml)

最確数

100ml

95%

信頼限界

下限    上限

4-2-0

    22

   9.0    56

0-0-0

<2

− 4-2-1      26

 12

  65

0-0-1

  2

  1.0

10 4-3-0

    27

 12

  67

0-1-0

  2

  1.0

10 4-3-1

    33

 15

  77

0-2-0

  4

  1.0

13 4-4-0

    34

 16

  80

5-0-0

     23

   9.6    86

1-0-0

  2

  1.0

11 5-0-1

     30

 10

 110

1-0-1

  4

  1.0

15 5-0-2

     40

 20

 140

1-1-0

  4

  1.0

15 5-1-0

     30

 10

 120

1-1-1

  6

  2.0

18 5-1-1

     50

 20

 150

1-2-0

  6

  2.0

18 5-1-2

     60

 30

 180

2-0-0

  4

  1.0

17 5-2-0

     50

 20

 170

2-0-1

  7

  2.0

20 5-2-1

     70

 30

 210

2-1-0

  7

  2.0

21 5-2-2

     90

 40

 250

2-1-1

  9

  3.0

24 5-3-0

     80

 30

 250

2-2-0

  9

  3.0

25 5-3-1

    110

 40

 300

2-3-0

12

  5.0

29 5-3-2

    140

 60

 360

3-0-0

  8

  3.0

24 5-3-3

    170

 80

 410

3-0-1

11

  4.0

29 5-4-0

    130

 50

 390

3-1-0

11

  4.0

29 5-4-1

    170

 70

 480

3-1-1

14

  6.0

35 5-4-2

    220 100

580

3-2-0

14

  6.0

35 5-4-3

    280 120

690

3-2-1

17

  7.0

40 5-4-4

    350 160

820

5-5-0

    240 100

940

4-0-0

13

  5.0

38 5-5-1

    300 100 1

300

4-0-1

17

  7.0

45 5-5-2

    500 200 2

000

4-1-0

17

  7.0

46 5-5-3

    900 300 2

900

4-1-1

21

  9.0

55 5-5-4

  1 600

600

5 300

4-1-2

26

12

63

5-5-5

≧1 600


9

K 0350-20-10 : 2001

1.  最確数の求め方の例

陽性管列の例が

表 に示すようになった場合の最確数の算出は,次による。

表 2  陽性管列の例*

希釈倍数

希釈試料の培養量 (ml)

希釈なし

10

希釈なし

1

10

1

100

1

薄めない試料の相当量 (ml)

10

1

0.1

0.01

陽性管列の例 1)

2)

3)

4)

4')

5/5

5/5 

0/5 

5/5 

5/5

5/5 

4/5 

1/5 

3/5 

3/5

2/5 

2/5 

0/5 

1/5 

2/5

0/5 

0/5

0/5

1/5 

0/5

*

上水試験方法(1993 年版)

:厚生省生活衛生局水道環境部監修,社団法人日

本水道協会  発行を参考とした。

分母は試験管数,分子は陽性管の数を示す。 
太字体は,最確数を表から求める際に採用する 3 希釈段階の陽性管列を示す。

2.  表2の陽性管列の例が1)の場合は,ある希釈段階で試験本数の一部が陽性となり,それより1段

階下位の希釈段階ですべて陰性,それより(一部が陽性となった)1段階上位の希釈段階ですべ

て陽性の場合は,一部が陽性となった希釈段階を中位において,連続した3段階の希釈段階から

なる陽性管列を採用する。すなわち,陽性管列5, 2, 0を採用し,

1に照らして対応する最確数

50

を得る。最確数の算出に採用した上位,中位,下位の3段階からなる陽性管列の上位の希釈段

階の培養量は試料1ml(希釈していない)であるので,

1で求めた最確数50に,倍数10を乗じ

て500個/100ml を試料の最確数とする。

3.  表2の陽性管列の例が2)の場合は,連続した二つの希釈段階で試験本数の一部が陽性となり,そ

れより下位の希釈段階ですべて陰性,それより(一部が陽性となった)上位の希釈段階ですべ

て陽性の場合は,上位の希釈段階だけすべて陽性となるような陽性管列を採用する。すなわち,

陽性管列5, 4, 2を採用し,

1に照らして対応する最確数として220を得る。採用した3段階の陽

性管列の上位の希釈段階の培養量は試料10ml であるので,この値をそのまま試料の最確数[220

(個/100ml)

]とする。

4.  表2の陽性管列の例が3)の場合は,試験した最上位の試験段階ですべて陰性になっている。試料

を最も多く加えた段階ですべて陰性であることを重視して,試験した最上位の希釈段階を上位

の希釈段階とし,中位に陽性となった希釈段階をおいた陽性管列を採用する。すなわち,陽性

管列0, 1, 0を採用し,

1に照らして対応する最確数として2を得る。採用した3段階の陽性管列

の上位の希釈段階の培養量は試料10ml であるので,この値をそのまま試料の最確数[2(個/

100ml

]とする。

5.  表2の陽性管列の例が4)の場合は,試験した最下位の希釈段階でも一部が陽性になった場合は,

その1段階上の希釈段階の陽性管数に1を加えて

2の4')に示したような陽性管列とし,以下,

2.と同様に取り扱う。すなわち,陽性管列5, 3, 2を採用し,表1に照らして対応する最確数と

して140を得る。採用した3段階の陽性管列の上位の希釈段階の培養量は試料10ml であるので,

この値をそのまま試料の最確数[140(個/100ml)

]とする。

6.3

推定試験及び確定試験  ラクトース−ブロス培地(LB 培地)による推定試験とブリリアントグリー

ン−ラクトース−胆汁−ブロス培地(BGLB 培地)による確定試験を行って大腸菌群を判定する。


10

K 0350-20-10 : 2001

6.3.1

推定試験  ラクトース−ブロス培地(LB 培地)を用いて,36±1℃で 24±2 時間培養し,大腸菌群

の存在を推定する。

a)

試薬及び培地  試薬及び培地は,次による。

1)

水  3.3 による。

2)

希釈水  6.1.1b)による。

3)

ラクトース−ブロス(倍濃度)培地(LB2 倍濃度培地)(

5

)

  肉エキス 3g,ペプトン(カゼインの

パンクレアチン水解物を用いる。

)10g, JIS K 8728 に規定するラクトース一水和物 5g を水 500ml に

加え,加熱して溶かした後,滅菌後の pH が 7.0±0.1 になるように調節(

7

)

し,これにブロモチモー

ルブルー溶液 (2g/L) (

17

)12ml

を加える。これを 6.2.2d)のダーラム発酵管(中試験管)に約 10ml ず

つ移し入れ,3.5b)の高圧蒸気滅菌を約 15 分間行って手早く冷水中に浸して冷却した後,冷暗所に

保存する。ダーラム発酵管内に気泡が残留しているものは使用しない。

4)

ラクトース−ブロス(倍濃度)培地(LB3 倍濃度培地)(

5

)

  肉エキス 4.5g,ペプトン(カゼイン

のパンクレアチン水解物を用いる。

15g, JIS K 8728

に規定するラクトース一水和物 7.5g を水 500ml

に加え,加熱して溶かした後,滅菌後の pH が 7.0±0.1 になるように調節(

7

)

し,これにブロモチモ

ールブルー溶液 (2g/L) (

17

)18ml

を加える。これを 6.2.2d)のダーラム発酵管(大試験管)に約 25ml

ずつ移し入れ,3.5b)の高圧蒸気滅菌を約 15 分間行って手早く冷水中に浸して冷却した後,冷暗所

に保存する。ダーラム管内に気泡が残留しているものは使用しない。

5)

ブリリアントグリーン−ラクトース−胆汁−ブロス培地(BGLB 培地)(

5

)

  6.2.1c)による。

(

17

)  JIS K 8842

に規定するブロモチモールブルー0.2g を水約50ml 中に加え,水酸化ナトリウム溶液

(0.1mol/L)

JIS K 8576に規定する水酸化ナトリウムを用いて調製する。

)5ml を加えた後,約

50

℃に加熱して溶かし,放冷後,100ml とする。

備考  6.1.1 の備考による。ただし,培養時間は約 24 時間とする。

b)

器具及び装置  器具及び装置は,次による。

1)

メスピペット  6.2.2a)による。

2)

希釈瓶  6.1.2b)による。

3)

試験管  6.2.2c)による。

4)

ダーラム発酵管  6.2.2d)による。

5)

三角フラスコ  6.1.2e)による。

6)

綿栓  6.1.2f)による。

7)

培養器(ふ卵器)  6.1.2h)による。

8)

乾熱滅菌器  6.1.2i)による。

9)

高圧蒸気滅菌器  6.1.2j)による。

c)

器具などの滅菌操作  器具などの滅菌操作は,3.5a)3.5c)による。

d)

消毒操作  消毒操作は,3.6a)3.6c)による。

e)

操作  操作は,次のとおり行う。

1)

4.1b)1)

によって採取した試料(

8

)10ml(

18

)

ずつを全量ピペットで 5 本のラクトース−ブロス

(2 倍濃度)

培地(LB2 倍濃度培地)を入れたダーラム発酵管(中試験管)に加える。

2)

これを培養器に入れ,36±1℃で 24±2 時間培養する。

3)

気体の発生を認め,かつ,培地の色が黄色に変色したものを推定試験陽性とし,6.3.2 の確定試験を

行う。


11

K 0350-20-10 : 2001

4)

気体の発生が認められないものは,更に培養を続けて 48±3 時間まで延長する。

5)

気体の発生を認め,かつ,培地の色が黄色に変色したものを推定試験陽性とし,6.3.2 の確定試験を

行う。気体の発生が認められないものは,大腸菌群陰性と判定する。

(

18

)

試料中の大腸菌群数が少ないと予想される場合には,4.1b)1)によって採取した試料50ml[試料

が酸性又はアルカリ性の場合は

(

8

)

による。

]ずつを全量ピペット50ml[あらかじめ,b)1)と同

じ操作で滅菌したもの。

]で5本のラクトース−ブロス(3倍濃度)培地(LB3倍濃度培地)25ml

を入れたダーラム発酵管(大試験管)に加える。以下,2)5)の操作を行う。

備考  6.1.6 の備考 1.による。

6.3.2

確定試験  ブリリアントグリーン−ラクトース−胆汁−ブロス培地(BGLB 培地)を用いて,36

±1℃で 24±2 時間(又は 48±3 時間)培養し,大腸菌群の存在を確定する。

a)

試薬及び培地  試薬及び培地は,次による。

1)

水  3.3 による。

2)

ブリリアントグリーン−ラクトース−胆汁−ブロス培地(BGLB 培地)(

5

)

  6.2.1c)による。

b)

器具及び装置  器具及び装置は,次による。

1)

試験管  6.2.2c)による。

2)

ダーラム発酵管  6.2.2d)による。

3)

綿栓  6.1.2f)による。

4)

白金耳  直径 0.7∼0.8mm,長さ約 80mm の白金線又はニクロム線の先端を内径 2∼5mm の輪にし,

他端を柄に挿入したもの。使用の前後には,3.5c)の火炎滅菌を行う。

5)

培養器(ふ卵器)  6.1.2h)による。

6)

乾熱滅菌器  6.1.2i)による。

7)

高圧蒸気滅菌器  6.1.2j)による。

c)

器具などの滅菌操作  器具などの滅菌操作は,3.5a)3.5c)による。

d)

消毒操作  消毒操作は,3.6a)3.6c)による。

e)

操作  操作は,次のとおり行う。

1)

6.3.1e)3)

及び 5)によって推定試験陽性と判定されたものについて,その 1 白金耳量の菌液(培養液)

をブリリアントグリーン−ラクトース−胆汁−ブロス培地(BGLB 培地)を入れたダーラム発酵管

(中試験管)に移植する。

2)

これを培養器に入れ,36±1℃で 24±2 時間又は 48±3 時間培養する。

3)

気体の発生が認められないものは大腸菌群陰性,気体の発生が認められたものは確定試験陽性と判

定する。

備考  6.1.6 の備考 1.による。

7.

ふん便性大腸菌群の試験  ふん便性大腸菌群は,大腸菌群のうち EC 液体培地又は M-FC 寒天培地で

44.5

±0.2℃で,24±2 時間培養したとき,EC 液体培地に気体を生じるか,M-FC 寒天培地に青い集落を形

成する菌をいう。

7.1

試薬及び培地  試薬及び培地は,次による。

a)

水  3.3 による。

b)  EC

液体培地(

5

)

  ペプトン(カゼインのパンクレアチンの水解物を用いる。

)20g, JIS K 8728 に規定す

るラクトース一水和物 5g,

胆汁酸塩 (No.3) 1.5g, JIS K 9007 に規定するりん酸二水素カリウム 1.5g, JIS 


12

K 0350-20-10 : 2001

K 9017

に規定するりん酸水素二カリウム 4g 及び JIS K 8150 に規定する塩化ナトリウム 5g を水 1L に

溶かし,減菌後の pH が 6.9 になるように調節(

7

)

した後,ダーラム発酵管(中試験管)に約 10ml ずつ

移し入れ,3.5b)の高圧蒸気滅菌を約 15 分間行って手早く冷水中に浸して冷却した後,冷暗所に保存

する。ダーラム管内に気泡が残留しているものは使用しない。

c)

M-FC

寒天培地(

5

)

  トリプトース(又はバイオセイト)10g,プロテオーゼペプトン(又はポリペプト

ン)5g,酵母エキス(粉末)3g, JIS K 8728 に規定するラクトース一水和物 12.5g,胆汁酸塩 (No.3) 1.5g,

JIS K 8150

に規定する塩化ナトリウム 5g,アニリンブルー0.1g 及び JIS K 8263 に規定する寒天(粉末)

15g

を水 1L に加え,加熱して溶かし,約 45℃に冷却し,pH を 7.4 に調節(

7

)

する。直ちにその 15∼20ml

をペトリ皿に流し込み,固まらせる。この培地は 3.5b)の高圧蒸気滅菌は行わず,96 時間以内に使用

する。

備考  6.1.1 の備考による。ただし,培養条件は約 44.5℃で約 24 時間とする。

7.2

器具及び装置  器具及び装置は,次による。

a)

ろ過器(分離形)  4.1a)3)による。

b)

メンブレンフィルター  4.1a)4)による。

c)

ピンセット  4.1a)5)による。

d)

試験管  6.2.2c)による。

e)

ダーラム発酵管  6.2.2d)による。

f)

ペトリ皿  6.1.2c)による。

g)

綿栓  6.1.2f)による。

h)

白金耳  6.3.2b)4)による。

i)

集落計数器  6.1.2g)による。

j)

培養器  44.5±0.2℃に調節できるもの。恒温水槽が利用できる。

k)

乾熱滅菌器  6.1.2i)による。

l)

高圧蒸気滅菌器  6.1.2j)による。

7.3

器具などの滅菌操作  器具などの滅菌操作は,3.5a)3.5c)による。

7.4

消毒操作  消毒操作は,3.6a)3.6c)による。

7.5

操作  操作は,次のとおり行う。

a)

EC

液体培地を用いる場合

1)

6.3.1e)3)

及び 5)の操作で大腸菌群陽性と判定したダーラム発酵管から,その 1 白金耳量を EC 液体培

地に移植する。

2)

これを培養器に入れ,44.5±0.2℃で 24±2 時間培養する。

3)

気体の発生が認められたものを,ふん便性大腸菌群陽性とする。気体の発生が認められないものを,

ふん便性大腸菌群陰性とする。

b)  M-FC

寒天培地を用いる場合

1)

4.1b)2)

の操作を行って大腸菌群をメンブレンフィルターに捕集する。

2) M-FC

寒天培地を約 50℃の水浴中で加熱して解かした後,約 50℃に保ちながら,その約 15ml を無

菌的にペトリ皿にとる。水平に保って培地を固まらせる。

3)

ろ過器から,ピンセットを用いてメンブレンフィルターを取り外し,2)のペトリ皿中の培地上に捕

集面を上にして密着させる。このときメンブレンフィルターと培地の間に気泡が入らないように注

意する。


13

K 0350-20-10 : 2001

4)

ペトリ皿にふたをし,逆さにして培養器に入れ,44.5±0.2℃で 24±2 時間培養する。

5)

集落計数器を用いてメンブレンフィルター上に発生した青い集落を確認すれば,ふん便性大腸菌群

陽性と判定する。集落数を計数してふん便性大腸菌群数を求め,試料 100ml 中の個数で表す。

備考  6.1.6 の備考 1.による。

付表 1  引用規格

JIS K 0050

  化学分析方法通則

JIS K 0101

  工業用水試験方法

JIS K 0102

  工場排水試験方法

JIS K 0211

  分析化学用語(基礎部門)

JIS K 0550

  超純水中の細菌数試験方法

JIS K 0557

  用水・排水の試験に用いる水

JIS K 0950

  プラスチック製滅菌シャーレ

JIS K 8102

  エタノール (95) (試薬)

JIS K 8150

  塩化ナトリウム(試薬)

JIS K 8180

  塩酸(試薬)

JIS K 8263

  寒天(試薬)

JIS K 8576

  水酸化ナトリウム(試薬)

JIS K 8637

  チオ硫酸ナトリウム五水和物(試薬)

JIS K 8728

  ラクトース一水和物(試薬)

JIS K 8842

  ブロモチモールブルー(試薬)

JIS K 9007

  りん酸二水素カリウム(試薬)

JIS K 9017

  りん酸水素二カリウム(試薬)

JIS R 3503

  化学分析用ガラス器具

JIS R 3505

  ガラス製体積計

JIS T 1702

  ふ(孵)卵器

JIS T 7322

  医療用高圧蒸気滅菌装置

JIS T 7324

  医療用小形高圧蒸気滅菌器

JIS Z 0701

  包装用シリカゲル乾燥剤


14

K 0350-20-10 : 2001

平成 11 年度微生物・細菌関係 JIS 原案作成委員会  構成表(平成 12 年 3 月現在)

氏名

所属

(委員長)

並  木      博

横浜国立大学名誉教授

平  野  正  樹

1)

通商産業省環境立地局産業施設課

大  滝  昌  平

2)

通商産業省環境立地局環境政策課

吉  田  徳  久

3)

環境庁水質保全局水質規制課

佐  藤  寿  邦

横浜国立大学工学部

渡  辺  真利代

立正大学地球環境科学部

田  中  宏  明

建設省土木研究所下水道部

菅  谷  芳  雄

国立環境研究所地域研究グループ

土  屋  悦  輝

東京都立衛生研究所環境保健部

坂  本      勉

財団法人日本規格協会技術部

橋  本      進

財団法人日本規格協会技術部

梅  崎  芳  美

社団法人産業環境管理協会名誉参与

久  本  泰  治

社団法人日本分析機器工業会(株式会社日立製作所)

横  倉  清  治

社団法人日本環境測定分析協会(三菱マテリアル株式会社)

竹  島      正

社団法人日本下水道協会(東京都下水道局)

狩  野  久  直

日本錬水株式会社企画開発部

米  倉  茂  男

元東京都立工業技術センター(現東京都立産業技術研究所)

岩  崎  岩  次

社団法人日本工業用水協会

(事務局)

植  草  敏  雄

社団法人日本工業用水協会

本  郷  秀  昭

社団法人日本工業用水協会

備考

1)

:発足当初は谷  重男(通商産業省環境立地局産業施設課)

2)

:発足当初は後藤芳一(通商産業省環境立地局環境政策課)

3)

:発足当初は畑野  浩(環境庁水質保全局水質規制課)

                            ○は小委員会委員兼任

(文責  渡辺真利代)